申请日2011.01.19
公开(公告)日2011.09.07
IPC分类号G01N21/00; C12Q1/18; G01N33/18
摘要
本发明属于环境水体的检测方法领域，具体涉及一种污水急性生物毒性的检测方法。该方法通过对污水样品中的有机物进行萃取和浓缩，排除无机物的干扰后，运用淡水发光细菌——青海弧菌Q67进行检测，建立了准确检测污水水样急性生态毒性的方法。本方法最终结果准确、稳定、重现性好，是对现有方法的有效改进。
权利要求书
1.一种污水急性生物毒性的检测方法，其特征在于，该方法按下列步骤进行：
步骤一，样品处理：
按照标准取样方法采取污水样，并对样品进行如下处理：
(1)依次将7mL的二氯甲烷、7 mL的甲醇、7mL的纯水通过C18固相萃取小柱对柱子进行润湿活化;
(2)取500 mL经0.45 μm滤膜过滤后的污水样上柱，使污水样连续通过C18固相萃取小柱，并调节真空泵使流出液流速为3mL/min;
(3)待污水样全部流出柱后用5 mL纯水过洗柱子，接着继续真空抽气干燥15 min，而后将C18固相萃取小柱放入离心机中离心;
(4)用二氯甲烷洗脱柱子，收集洗脱液，并将所得洗脱液用高纯氮气吹干，然后用5mL体积分数为0.5%的二甲基亚砜溶解所得吹干物，得到浓缩样品溶液;
(5)将浓缩样品溶液用0.9%的生理盐水配制成系列浓度梯度的待检测样品溶液;
步骤二，青海弧菌Q67菌悬液的制备：
(1)将青海弧菌Q67菌种转接到50 mL液体培养基中，22℃条件下，培养10～12 h;
(2)将得到的菌体培养液在12000 rmp 条件下离心10 min 后弃去上清液，接着对沉淀的菌体细胞进行3次洗涤：即用10 mL 0.9%的生理盐水重悬、12000 rmp 离心10 min，然后将经洗涤的菌体细胞用10 mL 0.9%的生理盐水重悬，得到青海弧菌Q67菌悬液;
步骤三，污水样急性生物毒性的检测：
对步骤一中所得到的每个待检测样品溶液进行如下检测：
(1) 在1.5 mL样品检测管中加入100 μL待检测样品溶液，并取100 μL 0.9%的生理盐水加入1.5 mL对照检测管中作为空白对照样，其中样品及空白对照样均有3~5个平行样;
(2)上述各检测管中分别加入100 μL青海弧菌Q67菌悬液，且各检测管之间加菌悬液的时间间隔为15 s;
(3)菌悬液加入完900 s后，采用发光细菌检测仪，按照加青海弧菌Q67菌悬液的检测管的顺序，依次对各样品及对照样进行发光强度检测，读取其相对发光值;
步骤四，结果计算：
(1) 计算出对照样的相对发光值平均值I0和不同浓度待检测样品的相对发光值平均值I，按(式A)计算出不同浓度待检测样品对发光细菌的相对抑制率E;
(式A)
(2)以待检测样品的浓度为纵坐标，以不同浓度待检测样品的相对抑制率E为横坐标作定量标准曲线，并从该曲线上读取出相对抑制率为50%时所对应的浓度，即半数发光抑制率浓度EC50，EC50值越大，毒性越小;
(3)用(式B)计算总影响指数TII50，并以此来反映污水样品的生物毒性，TII50 值越大，毒性越大;
(式B)。
2.如权利要求1所述的污水急性生物毒性的检测方法，其特征在于，步骤二中所述的液体培养基中各成分相对于蒸馏水质量的质量分数为：胰胨：0.5%、酵母膏：0.5%、甘油：0.3%、MgCl2：0.32%、KBr：0.02%、CaSO4：0.01%、NaCl ：0.4%、KCl：0.4%，pH 为8.5±0.5。
说明书
一种污水急性生物毒性的检测方法
技术领域
本发明属于环境水体的检测方法领域，具体涉及一种污水急性生物毒性的检测方法。
背景技术
污水急性生物毒性检测方法主要有：鱼类急性毒性实验、水蚤类毒性实验、藻类毒性实验、微生物毒性实验等。其中，微生物毒性实验多采用发光细菌法，因其检测时间短、费用低，对实验条件和试验场地要求也较低，已得到广泛的应用。
然而，对天然水样直接进行发光细菌毒性试验常会因水体中存在一些可刺激发光细菌发光、生长的“非毒性”共存物质，而导致检测结果不稳定，重现性差。例如对NH3-N或PO4-P含量高的水体，由于其可刺激细菌发光或可作为细菌营养物质的作用掩盖了多种有机污染物的毒性，可能会低估一些物质的毒性，进而导致试验结果误差较大，重复性差。 除此之外，现有的方法对于检测过程中样品和菌种的具体用量没有明确规定，导致了检测结果存在不确定性，难以精确定量表述。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种污水急性生物毒性的检测方法，该方法通过对污水样品进行萃取和浓缩处理，排除无机成分的干扰，从而能利用淡水发光细菌——青海弧菌Q67进行定量检测，保证检测结果准确、稳定、重现性好。
为实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：
一种污水急性生物毒性的检测方法，其特征在于，所述方法按下列步骤进行：
步骤一，样品处理：
按照标准取样方法采取污水样，并对样品进行如下处理：
(1)依次将7 mL的二氯甲烷、7 mL的甲醇、7 mL的纯水通过C18固相萃取小柱对柱子进行润湿活化;
(2)取500 mL经0.45 μm滤膜过滤后的污水样上柱，使污水样连续通过C18固相萃取小柱，并调节真空泵使流出液流速为3mL/min;
(3)待污水样全部流出柱后用5 mL纯水过洗柱子，接着继续真空抽气干燥15 min，而后将C18固相萃取小柱放入离心机中离心;
(4)用二氯甲烷洗脱柱子，收集洗脱液，并将所得洗脱液用高纯氮气吹干，然后用5mL体积分数为0.5% 的二甲基亚砜溶解所得吹干物，得到浓缩样品溶液;
(5)将浓缩样品溶液用0.9%的生理盐水配制成一系列浓度梯度的待检测样品溶液;
步骤二，青海弧菌Q67菌悬液的制备：
(1) 将青海弧菌Q67菌种转接到50 mL液体培养基中，22℃条件下，培养10～12 h;
(2) 将得到的菌体培养液在12000 rmp 条件下离心10 min 后弃去上清液，接着对沉淀的菌体细胞进行3次洗涤：即用10 mL质量分数为0.9%的生理盐水重悬、12000 rmp 离心10 min，然后将经洗涤的菌体细胞用10 mL 0.9%的生理盐水重悬，得到青海弧菌Q67菌悬液;
步骤三，污水样急性生物毒性的检测：
对步骤一中所得到的每个待检测样品溶液进行如下检测：
(1) 在1.5 mL样品检测管中加入100 μL待检测样品溶液，并取100 μL 0.9%的生理盐水加入1.5 mL对照检测管中作为空白对照样，其中样品及空白对照样均有3~5个平行样;
(2)上述各检测管中分别加入100 μL青海弧菌Q67菌悬液，且各检测管之间加菌悬液的时间间隔为15 s;
(3)菌悬液加入完900 s后，采用发光细菌检测仪，按照加青海弧菌Q67菌悬液的检测管的顺序，依次对各样品及对照样进行发光强度检测，读取其相对发光值;
步骤四，结果计算：
(1) 计算出对照样的相对发光值平均值I0和不同浓度待检测样品的相对发光值平均值I，按(式A)计算出不同浓度待检测样品对发光细菌的相对抑制率E;
(式A)
(2)以待检测样品的浓度为纵坐标，以不同浓度待检测样品的相对抑制率E为横坐标作定量标准曲线，并从该曲线上读取出相对抑制率为50%时所对应的浓度，即半数发光抑制率浓度EC50，EC50值越大，毒性越小;
(3)用(式B)计算总影响指数TII50，并以此来反映污水样品的生物毒性，TII50 值越大，毒性越大。
(式B)
步骤二中所述的液体培养基中各成分相对于蒸馏水质量的质量分数为：胰胨：0.5%、酵母膏：0.5%、甘油：0.3%、MgCl2：0.32%、KBr：0.02%、CaSO4：0.01%、NaCl ：0.4%、KCl：0.4%，pH 为8.5±0.5。
本发明与现有检测方法比较，具有下列特点：
(1)该检测方法采用C18固相萃取小柱对污水原样进行预处理，排除可刺激细菌发光或可提供细菌营养的无机物，减少其对检测结果的干扰。
(2)步骤三中通过对检测样品和菌悬液加入量的精确定量，保证了检测结果的稳定性和重现性。
具体实施方式
本发明通过对污水样品进行前处理，改进样品检测体系，为污染水体的急性生物毒性评价提供一种准确检测方法，并运用淡水发光细菌——青海弧菌Q67，可使检测结果更加稳定，检测的重现性有了大幅度提高。该方法具体包括下列步骤：
步骤一，样品处理：
按照标准取样方法采取污水样，并对样品进行如下处理：
(1)依次将7 mL的二氯甲烷、7 mL的甲醇、7 mL的纯水通过C18固相萃取小柱对柱子进行润湿活化，中间不允许填料抽干;
(2)取500 mL经0.45 μm滤膜过滤后的污水样上柱，使污水样连续通过C18固相萃取小柱富集有机物，调节真空泵的真空度，使流出液流速为3mL/min;
(3)待污水样全部流出柱后用5 mL纯水过洗柱子，接着继续真空抽气干燥15 min，而后将C18固相萃取小柱放入离心机中离心，以进一步除去柱体上残留的水珠，保证柱体的干燥;
(4)用二氯甲烷洗脱柱子，收集洗脱液，并将所得洗脱液用高纯氮气吹干，然后用5mL体积分数为0.5% 的二甲基亚砜溶解所得吹干物，得到浓缩样品溶液;
(5)将浓缩样品溶液用0.9%的生理盐水配制成一系列浓度梯度的待检测样品溶液;
步骤二，青海弧菌Q67菌悬液的制备：
(1)将青海弧菌Q67斜面菌种转接到50 mL液体培养基中，22℃培养10～12 h;所用液体培养基中各成分相对于蒸馏水质量的质量分数可为：胰胨：0.5%、酵母膏：0.5%、甘油：0.3%、MgCl2 ：0.32%、KBr：0.02%、CaSO4：0.01%、NaCl 0.4%、KCl ：0.4%、其余为蒸馏水，其pH 为8.5±0.5;
(2)将得到的菌体培养液12000 rmp 离心10 min 后弃去上清夜，接着对沉淀的菌体细胞进行3次洗涤：即用10 mL 0.9%的生理盐水重悬、12000 rmp 离心10 min，然后将经洗涤的菌体细胞用10 mL 0.9%的生理盐水重悬，所得菌悬液用于水样生物毒性检测。
步骤三，污水样急性生物毒性的检测：
对步骤一中所得到的每个待检测样品溶液进行如下检测：
(1) 在1.5 mL样品检测管中加入100 μL待检测样品溶液，并取100 μL 0.9%的生理盐水加入1.5 mL对照检测管作为空白对照样，其中样品及空白对照样均有3~5个平行样;
(2) 上述各检测管中分别加入100 μL青海弧菌Q67菌悬液，且各检测管之间加菌悬液的时间间隔为15 s;
(3) 菌悬液加入完900 s后，采用发光细菌检测仪，按照加青海弧菌Q67菌悬液的检测管的顺序，依次对各样品及对照样进行发光强度检测，读取其相对发光值;
步骤四，结果计算：
(1) 计算出对照样的相对发光值平均值I0和不同浓度待检测样品的相对发光值平均值I，按(式A)计算出不同浓度待检测样品对发光细菌的相对抑制率E;
(式A)
(2)以待检测样品的浓度为纵坐标，以不同浓度待检测样品的相对抑制率E为横坐标作定量标准曲线，并从该曲线上读取出相对抑制率为50%时所对应的浓度，即半数发光抑制率浓度EC50，EC50值越大，毒性越小;
(3)用(式B)计算总影响指数TII50，并以此来反映污水样品的生物毒性，TII50 值越大，毒性越大。
(式B)
以下是发明人给出的一个具体的实施例：
主要设备：
ModulusTM 单管型多功能检测仪(美国Turner Biosystems公司);
真空泵(GAST真空泵，中国);
C18固相萃取小柱(500mg 3ml PK54，德国)。
化学试剂：
二氯甲烷、甲醇、二甲基亚砜(均为上海化学试剂厂产品，分析纯)。
检测步骤：
本实施例中的各检测污水样是在某污水处理厂各处理单元采取，五个取样点分别为原水、曝气池出水、氧化沟出水、终沉池出水、紫外消毒出水，对各取样点的样品进行如下检测试验：
步骤一，样品处理：
按标准取样方法采取污水样，对样品进行如下处理：
(1)依次将7 mL的二氯甲烷、7 mL的甲醇、7 mL的纯水通过柱体进行润湿活化，中间不允许填料抽干;
(2)取500 mL经0.45 μm滤膜过滤后的水样上柱，使污水样连续通过C18固相萃取小柱富集有机物，调节真空泵的真空度，使流出液流速为3 mL/min;
(3)水样全部流出柱后再用5 mL纯水过洗柱子，接着继续对柱体进行真空抽气干燥15 min，而后将C18固相萃取小柱放入离心机中离心15 min，转速4000 rmp;
(4)用10mL二氯甲烷洗脱柱子，收集洗脱液，并将所得洗脱液用高纯氮气吹干，然后用5mL体积分数为0.5% 的二甲基亚砜溶解所得吹干物，得到浓缩样品溶液;
(5)将浓缩样品溶液用0.9%的生理盐水配制成最大浓缩倍数的10%、20%、40%、50%、60%、80%、100% 浓度梯度的待检测样品溶液;
步骤二，青海弧菌Q67菌悬液的制备：
(1)将4℃保存的青海弧菌Q67斜面菌种转接到50 mL液体培养基中，培养基的成分为：蒸馏水：50ml、胰胨：0.25g、酵母膏：0.25 g、甘油：0.15 g、MgCl2：0.16 g、KBr：0.01 g、CaSO4：0.005 g、NaCl ：0.2 g、KCl ：0.2 g，pH 为8.5±0.5，22℃培养10～12 h;
(2)将菌体培养液12000 rmp 离心10 min 后弃去上清夜，接着对沉淀的菌体细胞进行3次洗涤：即用10 mL 0.9%的生理盐水重悬、12000 rmp 离心10 min，然后将经洗涤的菌体细胞用10 mL 0.9%的生理盐水重悬，得到菌悬液;
步骤三，污水样急性生物毒性的检测：
对步骤一中所得到的每个待检测样品溶液进行如下检测：
(1) 在1.5 mL样品检测管中加入100 μL水样品溶液，并取100 μL 0.9%的生理盐水加入1.5 mL对照检测管作为空白对照样，其中水样与空白对照样均有5个平行样;
(2) 上述各样品检测管中分别加入100 μL青海弧菌Q67菌悬液，且各检测管之间加菌悬液的时间间隔为15 s;
(3) 菌悬液加入完900 s后，采用ModulusTM 单管型多功能检测仪，按照加青海弧菌Q67菌悬液的检测管的顺序，依次对各样品及空白样进行发光强度检测，读取其相对发光值;
步骤四，结果计算：
(1) 计算出对照样的相对发光值平均值I0和不同浓度待检测样品的相对发光值平均值I，按(式A)计算出不同浓度待检测样品对发光细菌的相对抑制率E;
(式A)
(2)以待检测样品的浓度为纵坐标，以不同浓度待检测样品的相对抑制率E为横坐标作定量标准曲线，并从该曲线上读取出相对抑制率为50%时所对应的浓度，即半数发光抑制率浓度EC50，EC50值越大，毒性越小;
(3)用(式B)计算总影响指数TII50，并以此来反映污水样品的生物毒性，TII50 值越大，毒性越大。
(式B)