申请日2011.06.01
公开(公告)日2011.11.23
IPC分类号C12N1/00; C12N1/20; C12R1/125; C12R1/01; C12N9/00
摘要
本发明涉及一种处理污水污泥的酶菌复合剂的制备方法，包括如下步骤：(1)备料枯草芽孢杆菌粉剂;(2)制备光合细菌菌液;(3)通过采集、培养和富集培养，获得土著菌;(4)工作菌的驯化培养：按不同的淤泥负荷投加土著菌及复合培养基，同时加入占总重量0.1～0.4%的枯草芽孢杆菌酶粉剂，1～3%的光合细菌菌液，进行不同负荷、不同有机物质浓度的试验，确定最佳参数，重复3次;(5)工作酶菌复合剂的驯化扩大培养，最终获得驯化工作酶菌复合剂，每毫升活菌数cfu 107～109/ml。本发明制备的酶菌复合剂能高效、简便地处理污水淤泥，在任何污水环境中适应性极强，对当地环境中的有益分解菌类具有引导和协同作用。
权利要求书 [支持框选翻译]
1.一种处理污水污泥的酶菌复合剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)备料：枯草芽孢杆菌粉剂;
(2)制备光合细菌菌液：首先将沼泽红假单胞菌种进行种子培养，接种量为 3%，温度为26～30℃之间，培养7～10天，得到种光合细菌液;然后，进行发酵培 养，把发酵培养基和占总重量的5～10%的待分离的污水或污泥混合，将pH值调至 6.5～7.5，然后在121℃下高温灭菌20分钟，待冷却后，接入种光合细菌液，接种量 为1～5%，在温度28～30℃，厌氧光照下培养5～7天，培养液由无色变为红色，获得 深红色的光合细菌菌液;
(3)土著菌的采集和培养：
i.土著菌的采集：从待处理的污水或污泥中取样，置于无菌器皿中;
ii.土著菌的培养：待处理的污水或污泥与微生物培养基的重量比为97∶3～9∶1， 在23～33℃，pH为6.5～7.5下培养5～10天;
iii.土著菌的富集培养：按10%的接种量在培养基中加入ii所得的土著菌，在 pH值为6.5～7.5，温度为23～33℃的条件下培养5～10天，获得土著菌;
(4)工作菌的驯化培养：用逐渐增加培养液中污水或污泥浓度的方法进行驯化， 按不同的淤泥负荷投加土著菌及复合培养基，同时加入占总重量0.1～0.4%的枯草芽 孢杆菌酶粉剂，1～3%的光合细菌菌液，进行不同负荷、不同有机物质浓度的试验， 根据微生物生长情况确定驯化的最佳参数，重复3次得驯化工作酶菌复合剂;
(5)工作酶菌复合剂的驯化扩大培养：根据驯化培养最佳参数，加入驯化工 作菌及复合培养基后，同时加入占总重量0.1～0.4%的枯草芽孢杆菌酶粉剂，1～3% 的光合细菌菌液，在温度23～32℃下培养5～7天，获得驯化工作酶菌复合剂。
2.根据权利要求1所述的处理污水污泥的酶菌复合剂的制备方法，其特征在 于：步骤(1)中，所述的枯草芽孢杆菌粉剂的制备方法，包括以下步骤：
①种子培养：在种子罐中装入种子培养基，取斜面菌种制成的枯草芽孢杆菌细 胞悬液按1%接种量接入种子罐，30℃，通风量1∶1.2体积比，350rpm，培养8小 时;
②发酵培养：在发酵罐中装入发酵培养基，将种子罐中的菌种培养液流加接种， 流加持续5min，接种量10%，30℃，300rpm，通风量1∶0.4体积比，培养8小时; 然后提高通风量为1∶0.6体积比，培养12小时;最后改变通风量为1∶0.8体积比， 流加5%体积的发酵补料液，持续20min，补料发酵，再培养12～16小时;
③将发酵后的菌液加入占总重量18～25%的改性淀粉、2～5%的斜发沸石粉，搅 拌混匀，采用高速离心喷雾干燥机进行喷雾干燥，制成枯草芽孢杆菌酶粉剂。
3.根据权利要求2所述的处理污水污泥的酶菌复合剂的制备方法，其特征在 于：步骤①中，所述的种子培养基由蛋白胨、牛肉浸取物、NaCl、琼脂和蒸馏水组 成;步骤②中，所述的发酵培养基由豆粨粉、玉米粉、麸皮、Na2HPO4、KH2PO4和蒸馏水组成，所述的发酵补料液由蚕蛹、石灰和水按100∶6∶600的重量比例， 混合均匀，在1.0×105pa蒸汽压力下加热水解1小时，制成。
4.根据权利要求1所述的处理污水污泥的酶菌复合剂的制备方法，其特征在 于：步骤(2)中，所述的种子培养采用种子培养基，其组成为磷酸二氢钾、氯化 钙、碳酸氢钠、乙酸钠、氯化镁、氯化铵、氯化钠、酵母粉、微量元素溶液、生长 因子、琥珀酸钠、蛋白胨和蒸馏水组成，其中，微量元素溶液包括四水氯化亚铁、 氯化钴、氯化镍、氯化铜、氯化锰、氯化锌、硼酸、钼酸钠、亚硒酸钠和蒸馏水， 生长因子包括生物素、烟酸、盐酸硫胺素、对氨基苯甲酸、盐酸吡哆胺、泛酸钙、 维生素B12和蒸馏水;所述的发酵培养基由氯化铵、醋酸钠、氯化镁、氯化钙、磷 酸二氢钙、磷酸氢二钾、酵母膏和蒸馏水组成。
5.根据权利要求1所述的处理污水污泥的酶菌复合剂的制备方法，其特征在 于：步骤(3)ii中，原始工作菌种的培养步骤为：采用葡萄糖、硫酸镁、磷酸二氢 钾、碳酸钙和蒸馏水组成的培养基，先将培养基的pH调至6.5～7.5，再在121℃高 温灭菌20分钟，待冷却后，加入占总重量3～5%待分离的污水或污泥，在温度 23～33℃，放置于通风黑暗处培养3～4天，培养液由无色变为黄色，然后再转接培 养3次，获得黄色菌液。
6.根据权利要求1所述的处理污水污泥的酶菌复合剂的制备方法，其特征在 于：步骤(3)ii中，原始工作菌种的培养步骤为：采用由牛肉膏、蛋白胨、氯化钠 和蒸馏水组成的培养基，先将培养基的pH调至6.5～7.5，再在121℃高温灭菌20分 钟，待冷却后，加入占总重量5～10%待分离的污水或污泥，在温度20～30℃，放置 于通风黑暗处培养3～4天，培养液由无色变为淡黄色，然后再转接培养3次，获得 浅黄色菌液。
7.根据权利要求1所述的处理污水污泥的酶菌复合剂的制备方法，其特征在 于：步骤(3)ii中，原始工作菌种的培养步骤为：采用由磷粉、磷酸二氢钾、磷酸 氢二钾、蛋白胨、氯化钠、有机磷和蒸馏水组成的培养基，先将培养基的pH调至 6.5～7.5，再在121℃高温灭菌20分钟，待冷却后，加入占总重量3～5%待分离的污 水或底泥，在温度25～30℃，放置于通风黑暗处培养3～4天，培养液由无色变为淡 黄色，然后再转接培养2次，获得浅黄色菌液。
8.根据权利要求1所述的处理污水污泥的酶菌复合剂的制备方法，其特征在 于：步骤(3)ii中，所述的微生物培养基由氮源、碳源、无机离子、有机物、生长 促进因子和蒸馏水组成;步骤(3)iii中，所述的培养基由磷酸氢钙、磷酸二氢钾、 磷酸氢二钾、蛋白胨、酵母膏、碳酸钙、硫化钠、硫酸铵和蒸馏水组成。
9.根据权利要求1所述的处理污水污泥的酶菌复合剂的制备方法，其特征在 于：所述的复合培养基由培养基原料和待处理污水或污泥按照重量比为1∶20～50 混合，经发酵、过滤而成，培养基原料由腐树叶粉、锯末、麦饭石粉、铁锈粉、益 生复合菌发酵的泔水渣和乳酸组成。
10.根据权利要求1所述的处理污水污泥的酶菌复合剂的制备方法，其特征在 于：所获得的驯化工作酶菌复合剂中，每毫升活菌数为107～109cfu/ml。
说明书 [支持框选翻译]
一种处理污水污泥的酶菌复合剂的制备方法
技术领域
本发明涉及一种处理污水污泥(淤泥)的酶菌复合剂的制备方法，该酶菌复合 剂可用于处理城市生活污水、畜禽养殖废水、沼液以及河湾、湖泊、池塘、沼泽、 景观等在水流不流动或水流非常缓慢的封闭或半封闭水域中的污水淤泥，属于环境 保护技术领域。
背景技术
水环境是地球生态环境中重要的组成部分，随着经济的发展，水污染也是一个 不可忽视的问题。我国的城市由于工商业集中、人口密集，生活污水的产生量大， 污染物的种类多且负荷高。城市污水的80%为生活污水且以粪便、腐烂物等污水为 主，水体的污染属于典型的有机污染类型。这些含量极高的有机污染物，在有害微 生物的控制下，对其进行氧化腐败分解，并产生大量的NH3、H2S、沼气等有害气 体，使水体变质、发黑，产生浓郁恶臭味，造成生态环境恶化，影响城市居民正常 生产生活，对社会和经济的发展都带来一系列的问题。水污染对环境造成严重的危 害，因此城市生活污水的净化处理是环境保护的一个重要内容，也是提高城市居民 健康质量的一个重要方面。此外，随着我国氮肥施用量的迅猛增加，大量的氮、磷 营养元素在湖泊、水库、池塘、沼泽等封闭或半封闭水体和一些河流水体内“富集”， 在过剩的营养条件下，造成水质恶化，水生物大量死亡，河床淤泥迅速增加的恶果， 使水资源逐渐枯竭。水体富营养化问题已成了解决水污染问题和环境保护问题的关 键。
目前许多城市都建设各种污水处理厂，但所见的生活污水处理大多采用化学方 法或物理方法，这些方法不仅工作量大，运行成本高，处理十分困难，还存在使水 体受到第二次污染的问题。经长期科学实践发现，自然界存在着大量的微生物菌株 资源，其中良性循环的微生物生态系统中由各种益生菌群组成的“菌团”承担着物 质循环与净化环境的主要责任。在污水处理方面，微生物对污染物的降解和转化潜 力巨大，微生物“吃掉”了污水中的有机物，这样污水变成了干净的水。它本质上 与自然界水体自净过程相似，只是经过人工添加益生菌强化，使污水净化的效果更 好。
主要有以下一些优点：
1.微生物个体微小，代谢速率快，易采集。
2.微生物种类繁多，分布广泛，代谢类型多样。
3.微生物能合成各种即具有专一性又具有诱导性的降解酶，可通过其灵活的代 谢调控机制将环境中的污染物进行降解转化。
4.微生物繁殖快，易变异，适应性强。
5.共同代谢作用对于难降解污染物的彻底分解有重要作用。
近百年以来，发达国家利用微生物如细菌、藻类来治理污水的商业实例很多， 例如活性污泥法是一种污水的好氧生物处理法，由英国的克拉克(Clark)和盖奇 (Gage)于1912年发明。1914年，第一座活性污泥法污水处理厂在英国曼彻斯特 建立。如今，活性污泥法及其衍生改良工艺是处理城市污水最广泛使用的方法。它 能从污水中去除溶解性的和胶体状态的可生化有机物以及能被活性污泥吸附的悬 浮固体和其他一些物质，同时也能去除一部分磷素和氮素。德国在微生物载体存在 下，将废水和活性污泥混合，使污水被微生物氧化，从而达到净化污水的目的。但 以上方法普遍存在微生物驯化培养条件苛刻，雨季污水负荷超大时效果不明显，应 用不够广泛等问题，以及占地面积大，设备成本高等不足之处，不能广泛应用于大 面积的污水淤泥的处理工程。
研究认为导致效果不佳的最主要原因是将有分解能力的益生菌加入需处理的 污水淤泥后，其水环境中氮、磷等高浓度的有机物、脂类、重金属等物质造成部分 微生物的功能丧失及死亡;水环境中存在的一些与益生菌相克的有害微生物，普通 益生菌的适应能力及协同作用不强，在与环境相磨合的过程中损耗过大，使其不能 高效、优质地发挥，从而无法彻底处理污水中的有害物质，造成治理失败。
发明内容
本发明的目的是提供一种能高效、简便地处理污水淤泥，在任何污水环境中适 应性极强，对当地环境中的有益分解菌类具有引导和协同作用的酶菌复合剂(酶菌 合剂)的制备方法。
为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：
一种处理污水污泥的酶菌复合剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)备料：枯草芽孢杆菌粉剂;
(2)制备光合细菌菌液：首先将沼泽红假单胞菌种进行种子培养，接种量为 3%，温度为26～30℃之间，培养7～10天，得到种光合细菌液;然后，进行发酵培 养，把发酵培养基和总重量的5～10%的待分离的污水或污泥混合，将pH值调至 6.5～7.5，然后在121℃下高温灭菌20分钟，待冷却后，接入种光合细菌液，接种量 为1～5%，在温度28～30℃，厌氧光照下培养7～10天，培养液由无色变为红色，获 得深红色的光合细菌菌液;
(3)土著菌的采集和培养：
i.土著菌的采集：从待处理的污水或污泥中取样，置于无菌器皿中;
ii.土著菌的培养：待处理的污水或污泥与微生物培养基的重量比为97∶3～9∶1， 在23～33℃，pH为6.5～7.5下培养7～10天;
iii.土著菌的富集培养：按10%的接种量在培养基中加入ii所得的土著菌，在 pH值为6.5～7.5，温度为23～33℃的条件下培养5～10天，获得土著菌群;
(4)工作菌的驯化培养：用逐渐增加培养液中污水或污泥浓度的方法进行驯化， 按不同的淤泥负荷投加土著菌及复合培养基，同时加入占总重量0.1～0.4%的枯草芽 孢杆菌酶粉剂，1～3%的光合细菌菌液，进行不同负荷、不同有机物质浓度的试验， 根据微生物生长情况确定驯化的最佳参数，重复3次得驯化工作酶菌复合剂;
(5)工作酶菌复合剂的驯化扩大培养：根据驯化培养最佳参数，加入驯化工 作菌及复合培养基后，同时加入占总重量0.1～0.4%的枯草芽孢杆菌酶粉剂，1～3% 的光合细菌菌液，在温度23～32℃下培养5～7天，获得驯化工作酶菌复合剂。获得 的驯化工作酶菌复合剂中，每毫升活菌数为107～109cfu/ml。
步骤(1)中，所述的枯草芽孢杆菌粉剂可以购买或按照以下方法制备。
枯草芽孢杆菌粉剂的制备方法，包括以下步骤：
①种子培养：在种子罐中装入种子培养基，取斜面菌种制成的枯草芽孢杆菌细 胞悬液按1%(体积比)接种量接入种子罐，30℃，通风量1∶1.2体积比，350rpm， 培养8小时;步骤①中，所述的种子培养基由蛋白胨、牛肉浸取物、NaCl、琼脂和 蒸馏水组成，121℃灭菌20分钟，即得。种子培养基的具体组成为：蛋白胨10.0g、 牛肉浸取物3.0g、NaCl 5.0g、琼脂15.0g和蒸馏水1.0L。
②发酵培养：在发酵罐中装入发酵培养基，将种子罐中的菌种培养液流加接种， 流加持续5min，接种量10%，30℃，300rpm，通风量1∶0.4体积比，培养8小时; 然后提高通风量为1∶0.6体积比，培养12小时;最后改变通风量为1∶0.8体积比， 流加5%体积的发酵补料液，持续20min，补料发酵，再培养12～16小时;步骤②中， 所述的发酵培养基由豆粕粉、玉米粉、麸皮、Na2HPO4、KH2PO4和蒸馏水组成，121℃ 灭菌20分钟，即得。按照重量比，发酵培养基的组成为：豆粕粉1～3%，玉米粉3～5%， 麸皮4～6%，Na2HPO40.4%，KH2PO40.03%，余量为蒸馏水。所述的发酵补料液由 蚕蛹、石灰和水按100∶6∶600的重量比例，混合均匀，在1.0×105pa蒸汽压力下 加热水解1小时，制成蚕蛹水解液，作为发酵补料液。
③将发酵后的菌液加入占总重量18～25%的改性淀粉、2～5%的斜发沸石粉，搅 拌混匀，采用高速离心喷雾干燥机进行喷雾干燥，制成枯草芽孢杆菌酶粉剂。
步骤(2)中，所述的种子培养采用种子培养基，其组成为磷酸二氢钾、氯化 钙、碳酸氢钠、乙酸钠、氯化镁、氯化铵、氯化钠、酵母粉、微量元素溶液、生长 因子、琥珀酸钠、蛋白胨和蒸馏水。
所述的种子培养基的组成为：
其中，微量元素溶液包括四水氯化亚铁、氯化钴、氯化镍、氯化铜、氯化锰、 氯化锌、硼酸、钼酸钠、亚硒酸钠和蒸馏水。
微量元素溶液配方：
生长因子包括生物素、烟酸、盐酸硫胺素、对氨基苯甲酸、盐酸吡哆胺、泛酸 钙、维生素B12和蒸馏水。
生长因子配方：
生物素0.1g 烟酸0.35g 盐酸硫胺素0.3g 对氨基苯甲酸0.2g
盐酸吡哆胺0.1g 泛酸钙0.1g 维生素B120.05g 蒸馏水1.0L。
步骤(2)中，所述的发酵培养基由氯化铵、醋酸钠、氯化镁、氯化钙、磷酸 二氢钙、磷酸氢二钾、酵母膏和蒸馏水组成，按照重量比其组成为：氯化铵0.1～0.2%、 醋酸钠0.2～0.3%、氯化镁0.02～0.03%、氯化钙0.02～0.03%、磷酸二氢钙0.05～0.06%、 磷酸氢二钾0.05～0.06%、酵母膏0.05～0.07%、余量为蒸馏水。
步骤(3)ii中，土著菌的培养步骤为：采用葡萄糖、硫酸镁、磷酸二氢钾、碳 酸钙和蒸馏水组成的培养基，先将培养基的pH调至6.5～7.5，再在121℃高温灭菌 20分钟，待冷却后，加入占总重量3～5%待分离的污水或污泥，在温度23～33℃， 放置于通风黑暗处培养3～4天，培养液由无色变为黄色，然后再转接培养3次，获 得黄色菌液。按照重量百分比，培养基的具体组成为：葡萄糖0.5～1%、硫酸镁 0.01～0.02%、磷酸二氢钾0.01～0.02%、碳酸钙0.2～0.5%、作量为蒸馏水。此方法在 污水或污泥中富集硝化菌时适用。
步骤(3)ii中，土著菌的培养步骤还可以为：采用由牛肉膏、蛋白胨、氯化钠 和蒸馏水组成的培养基，先将培养基的pH调至6.5～7.5，再在121℃高温灭菌20分 钟，待冷却后，加入占总重量5～10%待分离的污水或污泥，在温度20～30℃，放置 于通风黑暗处培养3～4天，培养液由无色变为淡黄色，然后再转接培养3次，获得 浅黄色菌液。按照重量百分比，培养基的具体组成为：牛肉膏0.3%、蛋白胨0.5%、 氯化钠0.5%、余量为蒸馏水。此方法在污水或污泥中富集需氧菌时适用。
步骤(3)ii中，土著菌的培养步骤还可以为：采用由磷粉、磷酸二氢钾、磷酸 氢二钾、蛋白胨、氯化钠、有机磷和蒸馏水组成的培养基，先将培养基的pH调至 6.5～7.5，再在121℃高温灭菌20分钟，待冷却后，加入占总重量3～5%待分离的污 水或底泥，在温度25～30℃，放置于通风黑暗处培养3～4天，培养液由无色变为淡 黄色，然后再转接培养2次，获得浅黄色菌液。按照重量百分比，培养基的具体组 成为：磷粉0.02～0.05%、磷酸二氢钾0.01～0.02%、磷酸氢二钾0.01～0.02%、蛋白胨 0.3～0.5%、氯化钠0..3～0.5%、有机磷0.1～0.2%、余量为蒸馏水。此方法在污水或污 泥中富集解磷菌时适用。
步骤(3)ii中，所述的微生物培养基包括氮源、碳源、无机离子、有机物、生 长促进因子和蒸馏水。微生物培养基中，氮源含量为1～12wt%，碳源为2～18wt%， 无机离子0.05～1wt%，有机物25～5wt%，生长促进因子为0.01～0.5wt%、余量为蒸 馏水。
步骤(3)iii中，所述的培养基由磷酸氢钙、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、蛋白 胨、酵母膏、碳酸钙、硫化钠、硫酸铵和蒸馏水组成。按照重量比，培养基的组成 为：磷酸氢钙0.01～0.02%、磷酸二氢钾0.02～0.05%、磷酸氢二钾0.01～0.02%、蛋白 胨0.1～0.2%、酵母膏0.2～0.5%、碳酸钙0.01～0.02%、硫化钠0.005～0.01%、硫酸铵 0.005～0.01%、余量为蒸馏水，充分混合溶解，121℃高温灭菌20分钟，制得培养基。
步骤(4)和(5)中，所述的复合培养基由培养基原料和待处理污水或污泥按 照重量比为1∶20～50混合，经发酵、过滤而成，培养基原料包括腐树叶粉、锯末、 麦饭石粉、铁锈粉、益生复合菌发酵的泔水渣和乳酸。
按照质量百分比，复合培养基的具体组成为：
腐树叶粉55～65% 锯末10～25% 麦饭石粉2～3% 铁锈粉2～3%
益生复合菌发酵的泔水渣6～20% 乳酸5～10%。
微生物菌种是菌和酶的复合配方，生物体内的化学反应绝大多数属于酶促反应 (Enzyme catalysis)，指的是由酶作为催化剂催化进行的化学反应。在废水处理当 中，微生物吸收降解有机物同样也是酶促反应，而传统的接种污泥培菌法，所投加 的污泥需要逐步适应水质，然后分泌出相应的酶，才能进行下一步的反应，然而这 个过程通常都是缓慢以及容易受到阻碍的。而我们复配的诱导酶解决了这个问题， 同类产品中大部分使用的是副产酶，或者是单一的菌配方，都难以达到快速的效果。
研究报道许多污染严重的区域存在着一些比正常环境中净化能力更强的微生 物，这种净化能力是任何化学和物理方法都无法相比的，这主要是微生物为了适应 环境而在长期的进货过程中逐渐形成的。益生菌种及酶的选择是微生物治理污水成 功的根本，而能否较快适应所需处理的环境并发挥作用是治理成功的关键。
本发明的高效、高适应性酶、菌合剂处理污水淤泥的机理在于微生物生长和代 谢机制。任何微生物进入一个新环境都有一个逐渐适应的过程，在细胞数和细胞重 量不变的前提下，重新调整其小分子和大分子的组成以及酶和细胞结构成份，此时 细胞数和细胞重量不变，该阶段微生物对外界理化因子的抵抗力减弱，如果外界环 境不利于该微生物生长，其生长繁殖将受到限制，从而影响效力的发挥。本发明从 微生物生长和代谢机制出发，经过多年实践，找到了一种高效、高适应性处理各种 污水淤泥，特别是富营养环境中污水淤泥的酶菌复合剂制备方法。
因此，本发明制备的酶菌复合剂能高效、简便地处理污水淤泥，在任何污水环 境中适应性极强，对当地环境中的有益分解菌类具有引导和协同作用。