申请日2011.07.01
公开(公告)日2011.11.23
IPC分类号C12N1/20; C12N1/14; C02F3/34; C02F103/28; C12R1/365; C12R1/385; C12R1/645
摘要
本发明提供了一种造纸污水处理用复合菌剂的高密度培养方法，在高密度发酵用基础培养基中依次接种黄孢原毛平革菌ATCC20696、珊瑚色诺卡式菌ACCC 40100和铜绿假单胞菌于一定条件下进行发酵培养80～100h;本发明中设计的培养基具有价格低廉(仅为LB培养基的20%左右)、满足本复合菌剂的工业化高密度发酵要求;设计的发酵工艺控制条件达到了复合菌剂的高密度生产要求，实现了节省设备等生产要素的投资，混合菌剂发酵后各菌种比例及活性都符合要求的目的：按照本技术的控制要点，发酵结束后三种成分完全可以达到要求的比例，并且三种菌已经互相适应并保持各自的活性与降解污染物的能力，为复合菌剂的规模化生产及应用奠定了基础。
权利要求书
1.一种造纸污水处理用复合菌剂的高密度培养方法，所述方法包括：在 高密度发酵用基础培养基中依次接种黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)ATCC 20696、珊瑚色诺卡式菌(Nocardia coralline) ACCC 40100和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CGMCC No.1.239进行发酵培养，控制温度为28～32℃、pH5.0～7.5、溶解氧为 1～5mg·L-1，发酵过程中分批流加总体积为高密度发酵用基础培养基体 积10～20%的质量浓度50～60%的葡萄糖溶液，发酵总时间为80～100h; 所述高密度发酵用基础培养基组成如下：葡萄糖10～15g·L-1、大豆蛋 白胨10～15g·L-1、磷酸二氢钠8～12g·L-1、维生素B1 2～5mg·L-1、 生物素0.1～0.5mg·L-1、微量元素母液1～3mL·L-1、发酵用消泡剂0.1 mL.L-1、用磷酸调节pH至5.5;所述微量元素母液组成如下：COCl2·6H2O 1mg·ml-1、MnCl2·4H2O 6mg·ml-1、CuCl2·2H2O 0.6mg·ml-1、H3BO41.2mg·ml-1、Na2MoO4·2H2O 1mg·ml-1、Zn(CH3COO)2·2H2O 5.2mg·ml-1、 FeC6H5O7·5H2O 40mg·ml-1。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：接种黄孢原毛平革菌后培养 24h，再接种珊瑚色诺卡式菌，继续培养24h后再接种铜绿假单胞菌。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述葡萄糖溶液在接种铜绿 假单胞菌24h后开始流加，于36h内流加完毕。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：在接种黄孢原毛革菌后控制 pH在5.5±0.3，接种珊瑚色诺卡式菌后直至发酵结束控制pH在7.0±0.3。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述高密度发酵用基础培养 基组成如下：葡萄糖10g·L-1、大豆蛋白胨10g·L-1、磷酸二氢钠10g·L-1、 维生素B1 3mg·L-1、生物素0.4mg·L-1、微量元素母液2.5mL·L-1、发 酵用消泡剂0.1mL·L-1、用磷酸调节pH至5.5。
说明书
一种造纸污水处理用复合菌剂的高密度培养方法
(一)技术领域
本发明涉及一种造纸污水处理用复合菌剂的高密度培养方法。
(二)背景技术
造纸污水处理一般使用物理处理法和生物处理法相结合的二级处理 工艺，其中生物处理法主要是利用活性污泥来降解污水中的污染成份。在 现实生产实施过程中，活性污泥法常常遇到的一些不便或缺陷，比如：
1.冬季低温，毒性物质，负荷高，高盐度，经常造成系统崩溃。
2.硝化细菌难于培养，硝化系统不稳定，出水氨氮不达标。
3.水中芳香族、木质素等复杂有机成分无法被高效降解。
4.生化系统抗冲击能力低，稳定性差。
为了解决上述问题，生物增效技术被应用到包括造纸工业废水的各种污水处理过程中来。生物增效技术(Bioaugmentation technique)是一种 通过加入具有特定降解能力的生物菌群，增强污水处理系统自身处理效果 的高科技生物技术。通过添加具有特定降解功能的菌株以强化土著细菌的 功效，强化了土著微生物抗冲击负荷及降解某些化合物的能力。生物增效 技术的关键是筛选到对应特定污染物的相应微生物并实现工业化生产，目 前菌种筛选方面的研究较多，但是一般停留在实验室阶段，实际应用到工 业生产的极少。所以对特定菌剂的规模化生产研究还有待进一步加强。
高密度培养技术，在工业微生物领域亦称高密度发酵技术，是一种应 用一定的培养技术和设备来提高菌体生物量和目标产物时空产率的微生 物培养技术，现已成功应用于基因工程菌及其产物的生产中。实现高密度 发酵的途径主要有：1.培养基组成的优化;2.特殊营养物的添加;3.限 制代谢副产物的积累;4.流加补料策略等。高密度发酵技术的发展为各种 菌剂的规模化生产提供了可行的途径，所以针对不同用途微生物的高密度 发酵工艺研究将成为菌剂研发领域的一个热点方向。
目前，复合菌剂的生产方法主要是通过分别发酵各成分菌种，然后再 按照一定比例混合制成菌剂。这种生产方法的优点是：根据不同菌种的特 点，选择不同的培养基和发酵条件，可以达到各种菌的最优化生产，并且 最终菌剂的成分比例易于控制;但是这种方法也有一定不足，如：需要的 设备等生产要素多、混合后的菌剂其中的各种菌活性状态等不同，投加后 要有一段适应期或者出现由于竞争力不同而产生菌剂活菌比例出现较大 变化等。
(三)发明内容
本发明的目的在于设计一种专用于造纸污水处理的生物增效剂的高 密度培养技术，包含一种适于工业化生产该增效剂的培养基及生产该增效 剂的发酵控制工艺条件，从而达到节省设备等生产要素的投资及提高复合 菌剂的稳定性等效果。
本发明采用的技术方案是：
一种造纸污水处理用复合菌剂的高密度培养方法，所述方法包括：在高密 度发酵用基础培养基中依次接种黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)ATCC 20696、珊瑚色诺卡式菌(Nocardia coralline)ACCC 40100和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CGMCC No.1.239进 行发酵培养，控制温度为28～32℃、pH5.0～7.5、溶解氧为1～5mg·L-1，发 酵过程中分批流加总体积为高密度发酵用基础培养基体积10～20%的质量 浓度50～60%的葡萄糖溶液，发酵总时间为80～100h;所述高密度发酵用 基础培养基组成如下：葡萄糖10～15g·L-1、大豆蛋白胨10～15g·L-1、磷 酸二氢钠8～12g·L-1、维生素B12～5mg·L-1、生物素0.1～0.5mg·L-1、 微量元素母液1～3mL·L-1、发酵用消泡剂(PPE高效聚醚消泡剂，浙江 大学化工厂)0.1mL·L-1、用磷酸调节pH至5.5;所述微量元素母液组成 如下：CoCl2·6H2O 1mg·ml-1、MnCl2·4H2O 6mg·ml-1、CuCl2·2H2O 0.6mg·ml-1、 H3BO4 1.2mg·ml-1、Na2MoO4·2H2O 1mg·ml-1、Zn(CH3COO)2·2H2O 5.2mg·ml-1、FeC6H5O7·5H2O 40mg·ml-1。复合菌剂含有3种微生物，均是 具有能降解造纸污水中特定污染物的能力且无公害。发酵后得到的菌种成 分比例(w/w)为：黄孢原毛平革菌15～25%;铜绿假单胞菌65～75%; 珊瑚色诺卡式菌5～15%。上述三种菌的含量最佳优选值：黄孢原毛平革 菌含量20%;铜绿假单孢菌含量70%;珊瑚色诺卡式菌含量10%。
具体的，接种黄孢原毛平革菌后培养24h，再接种珊瑚色诺卡式菌， 继续培养24h后再接种铜绿假单胞菌。
所述葡萄糖溶液在接种铜绿假单胞菌24h后开始流加，于36h内流加 完毕，流加方式可选择指数增加的方式。
优选的，在接种黄孢原毛革菌后控制pH在5.5±0.3，接种珊瑚色诺 卡式菌后直至发酵结束控制pH在7.0±0.3，发酵过程中pH调节液为氨水。
所述高密度发酵用基础培养基最佳组成为：葡萄糖10g·L-1、大豆蛋 白胨10g·L-1、磷酸二氢钠10g·L-1、维生素B13mg·L-1、生物素0.4mg·L-1、 微量元素母液2.5mL·L-1、发酵用消泡剂(PPE高效聚醚消泡剂，浙江大 学化工厂)0.1mL·L-1、用磷酸调节pH至5.5。
发酵工艺过程如下：
(1)菌种的平板活化：
将保存在-80℃冰箱中的菌种取出，冰上融化，分别无菌操作接种于 相应的平板培养基中，30℃恒温培养48～72h，备用。
(2)种子液制备：
分别挑取平板培养基上的单菌落，无菌接种于装有相应培养基的三 角瓶中，30℃、以适当转速在水平摇床上培养24～36h。
(3)上罐发酵
首先将6.5L基础培养基放入10L发酵罐中，121℃灭菌25min，待 培养基冷却后，通入无菌空气并以180rpm的转速搅拌5min。停止通气， 设置此时的溶解氧水平为100%(约为7～8mg·L-1)。
将黄孢原毛平革菌种子液按照2%左右的体积比接种到发酵罐中， 控制pH在5.5±0.3的水平(设置发酵罐控制程序，由在线检测系统控制 的蠕动泵决定氨水的添加速度)，温度30℃，开始发酵;24h后再按同样 的接种量接种珊瑚色诺卡式菌，接种前调节pH到7.0±0.3，继续发酵24h; 然后接种铜绿假单孢菌，培养24h后开始补料。补料方式参考三种微生物 进入对数生长期的时机，按照指数形式的速度添加，设置1L的补料量的 补料时间为36h，补料结束后，继续发酵2h后结束发酵培养。整个发酵 培养过程中，通过改变搅拌桨转速及通入压缩空气或纯氧的方式控制溶解 氧水平在30%(约为2mg·L-1)以上。发酵结束后，发酵液中菌体干重达 到22.46g·L-1及以上。
本发明的有益效果主要体现在：本发明中设计的培养基具有价格低廉 (仅为LB培养基的20%左右)、满足本复合菌剂的工业化高密度发酵要 求;设计的发酵工艺控制条件达到了复合菌剂的高密度生产要求(发酵结 束后，发酵液中菌体干重达到22.46g·L-1及以上)，实现了节省设备等生 产要素的投资(如果三种成分分别进行生产，要么至少要三套发酵设备同 时使用、要么同一套设备要三个生产周期才能达到相同的效果，也就是说 设备等生产资料的投资可以节省60%以上);混合菌剂发酵后各菌种比例 及活性都符合要求的目的：按照本技术的控制要点，发酵结束后三种成分 完全可以达到要求的比例，并且三种菌已经互相适应并保持各自的活性与 降解污染物的能力，为复合菌剂的规模化生产及应用奠定了基础。