申请日2017.10.26
公开(公告)日2018.07.24
IPC分类号C12N15/54; C12N9/12; C12N1/21; C02F3/34; C02F101/10
摘要
本发明涉及一种多聚磷酸盐激酶基因及在污水除磷中的应用，具体涉及三个新型多聚磷酸盐激酶基因ppk33、ppk44、ppk73，分别具有如SEQ NO 1、SEQ NO 2和SEQ NO 3所示的核苷酸序列。本发明所述多聚磷酸盐激酶基因ppk33、ppk44、ppk73制备的工程菌，可用于去除污水中的磷元素，其中菌株M15/pQE30a‑ppk44是其对应对照菌株去磷量的7倍，10h聚磷率高达70%。
权利要求书
1.两种工程菌，其特征在于所述工程菌分别为BL21(DE3)/pET28a-ppk33、M15/pQE30a-ppk44;其中ppk33、ppk44的DNA序列分别具有如SEQ NO 1、SEQ NO 2所示的核苷酸序列。
2.权利要求1所述的两种工程菌在污水除磷中的应用。
3.两个新型多聚磷酸盐激酶基因ppk33、ppk44在制备工程菌BL21(DE3)/pET28a-ppk33、M15/pQE30a-ppk44中的应用;其中ppk33、ppk44的DNA序列分别具有如SEQ NO 1、SEQNO 2所示的核苷酸序列。
说明书
一种多聚磷酸盐激酶基因及在污水除磷中的应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种多聚磷酸盐激酶基因及在污水除磷中的应用。
背景技术
水体富营养化已成为全球问题且日趋恶化，近年来，大量的氮、磷、钾等元素被排入各种水体的速度远远超过其被消耗速度，水体的有机物不断积累，水生生态平衡被打破，水体富营养化已成为全球问题并日趋恶化(Yang X.E,Wu X.,Hao H.L.,HeZ.l.Mechanisms and assessment of water eutrophication[J].Journal of ZhejiangUniversity B,2008,3(3):197-209)。在所有的营养元素中，磷对藻类生长尤为重要，以磷为限制因子，当总磷浓度超过0.1mg/L，藻类就会过度繁殖(林晓,刘蜻,徐厚坤.富营养化水体中磷的控制方法初探[J].城镇供水,2003,2(1):29-30;Abell J.M.,Hamilton D.P.Nitrogen and phosphorus limitation of phytoplankton growth inNew Zealand lakes:implicatios for eutrophication control[J].Ecosystems,2010,13(7):966-977)。然而，无限制排放的磷进入水体生态系统后，还会发生复杂的吸附、固定和再释放过程，使污染水体更加难以治理(郑金伟,冉炜,钟增涛,何健.增强型生物除磷过程中聚磷酸盐积累微生物的研究进展[J].应用生态学报,2004,15(8),1487-1490)。磷是引起水体富营养化的重要因素，除去水体中积聚的磷是水体修复中亟待解决的关键问题。
聚磷菌的发现为解决水体中无机磷的富集问题起到了至关重要的作用，国内外学者相继筛选了很多具有聚磷能力的微生物，一般都是从高度富营养化水体的沉积物或活性淤泥中筛选得到，蔡天明等从城市污水处理厂好氧池活性污泥中分离获得一株Pseudomonas grimontii C18，在好氧培养24h后除磷率达94.1%(蔡天明,陈立伟,吴守中,钱丽花,任倩.1株脱氮除磷菌的筛选及其特性研究[J].环境科学,2010,31(10):2487-2492)。庄志刚等从福州市闽侯县上街镇高岐村某排污口淤泥中分离出1株高效聚磷菌—Alcaligenes sp.ZGED-12，经优化培养条件后对磷的去除能力可达80%(庄志刚,韩永和,章文贤,周志华,陈佳兴,李敏.高效聚磷菌Alcaligenes sp.ED-12菌株的分离鉴定及其除磷特性[J].环境科学学报,2014,34(3):678-687)。但是目前对红树林土壤聚磷菌的研究鲜见报道，红树林为潮滩湿地生物群落，长期遭受海水周期性浸淹，其生态环境与聚磷菌的聚磷过程好氧-厌氧交替环境高度一致，蕴藏着丰富的聚磷微生物资源。本申请发明人随机采集了东寨港红树林134份土壤样品，总共获得185株初筛菌株，有42株菌株的聚磷能力达到20%以上，其中Acinetobacter.tandoii SC36最高聚磷率可达到70%，这些菌株可为富营养化水体的快速、高效处理提供了有效的菌种资源。
发明内容
本发明中聚磷菌株Acinetobacter.tandoii SC36的16S rRNA基因序列已由发明人提交到GenBank数据中，其序列号为KU353550(GenBank:KU353550.1)。
本发明提供三个新型多聚磷酸盐激酶基因ppk33、ppk44、ppk73，其特征在于ppk33、ppk44、ppk73的DNA序列分别具有如SEQ NO 1、SEQ NO 2和SEQ NO 3所示的核苷酸序列。
本发明的另一实施方案提供三个蛋白质的氨基酸序列，其特征在于所述氨基酸序列分别具有如SEQ NO 4、SEQ NO 5、SEQ NO 6所示的氨基酸序列;所述氨基酸序列依次由SEQ NO1、SEQ NO 2和SEQ NO 3编码。
本发明的另一实施方案提供一种制备上述三个新型多聚磷酸盐激酶基因ppk33、ppk44、ppk73的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：
以菌株Acinetobacter.tandoii SC36基因组为模板，利用PCR的方法获得完整的基因片段ppk33、ppk44和ppk73。
上述PCR使用的引物与限制性内切酶如下：
ppk33引物F:CCATGGAAAATTTTCAACATTCATC，限制性内切酶NcoⅠ
R:GCTCGAGGATTTTCTGTAGACTCTTGTTCATC，限制性内切酶XhoⅠ
ppk44引物F:TGGATCCATGAATACGGCGGCACAGA，限制性内切酶BamHⅠ
R:TGTCGACTTATTTAATCATTTCCAACAAAGTC，限制性内切酶SalⅠ
ppk73引物F:TGGATCCTTGTCAATTTTAGATTTTAATTTACG，限制性内切酶BamHⅠ
R:TCTGCAGTTACTTTATAACGCTTAACAAAAAG，限制性内切酶PstⅠ
本发明的另一实施方案提供如下一对引物在制备多聚磷酸盐激酶基因ppk33中的应用，其特征在于所述引物如下：
F:CCATGGAAAATTTTCAACATTCATC
R:GCTCGAGGATTTTCTGTAGACTCTTGTTCATC。
本发明的另一实施方案提供如下一对引物在制备多聚磷酸盐激酶基因ppk44中的应用，其特征在于所述引物如下：
F:TGGATCCATGAATACGGCGGCACAGA
R:TGTCGACTTATTTAATCATTTCCAACAAAGTC。
本发明的另一实施方案提供如下一对引物在制备多聚磷酸盐激酶基因ppk73中的应用，其特征在于所述引物如下：
F:TGGATCCTTGTCAATTTTAGATTTTAATTTACG
R:TCTGCAGTTACTTTATAACGCTTAACAAAAAG。
本发明的另一实施方案提供三种大肠杆菌工程菌，其特征在于所述工程菌分别为BL21(DE3)/pET28a-ppk33、M15/pQE30a-ppk73、M15/pQE30a-ppk44。
本发明的另一实施方案提供上述三种工程菌在污水除磷中的应用。
本发明的另一实施方案提供上述三个新型多聚磷酸盐激酶基因ppk33、ppk44、ppk73在制备上述工程菌BL21(DE3)/pET28a-ppk33、M15/pQE30a-ppk73、M15/pQE30a-ppk44中的应用。
本发明的大概方案如下：
为进一步解析菌株SC36的除磷机制，采用Illumina Hiseq 2000测序技术完成高效聚磷菌株Acinetobacter.tandoii SC36的基因组扫描测序，构建300bp文库，利用SOAPdenovo v2.04拼接软件对优化序列进行多个Kmer参数的拼接，得到最优的组装结果后，再运用GapCloser v1.12软件对组装结果进行局部内洞填充和碱基校正。依据拼接序列的总长、scaffold的数量以及scaffold N50等技术指标，对多个Kmer的组装结果进行综合评定，最终SC36基因组测序分析获得了56个scaffold，GC含量为41.98%。
利用Glimmer 3.02软件进行细菌的基因预测，将预测基因的蛋白序列分别与Nr、genes、string和GO数据库进行blastp比对(BLAST 2.2.28+)，鉴定菌株SC36含有3个ppk基因，命名为ppk33(SEQ NO 1)、ppk44(SEQ NO 2)和ppk73(SEQ NO 3)，开放阅读框(ORF)大小分别为2061bp、2082bp和2010bp，分别编码686(SEQ NO 4)、693(SEQ NO 5)和669(SEQ NO6)个氨基酸。
利用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)来预测蛋白质的氨基酸序列(即一级结构)，发现3个PPK的分子量大小分别为78071.0Da、78869.5Da和76645.3Da，等电点(pI)的理论值分别为6.34、6.37和7.76。利用SOPMA(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)在线工具，将已知ppk基因编码的氨基酸序列进行二级结构预测。3个PPK的二级结构在主结构上相似(图1)，但是PPK33与PPK44和PPK73在N端0-100位、200-250位和350-400位氨基酸处均有较大差别，而PPK44与PPK73只在0-50位氨基酸处表现较大差异，说明PPK33的二级结构与PPK44和PPK73之间存在较大的差异性。3个PPK二级结构中α螺旋和无规卷曲所占比例较大，其中PPK33中α螺旋所占比例低于PPK44和PPK73，而无规卷曲所占比例则高于PPK44和PPK73，而β转角所占比例均较少，仅8%左右。利用SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)同源建模法对3个PPK的三级结构进行预测，发现3个蛋白模型大体相同，只在局部区域有差异(图2)。
以菌株Acinetobacter.tandoii SC36基因组为模板，利用PCR的方法获得完整的基因片段ppk33、ppk44和ppk73，3个目的片段均在2.0kb左右，与预期结果相符。将纯化回收后的PCR产物分别与pMD 18-T Vector进行酶连，转化E.coli JM109中，均匀涂布于含有Amp(100μg/mL)的LB平板上，挑取克隆子，提取克隆子的质粒并进行酶切验证。将酶切验证正确的克隆子和表达载体分别用相应的酶进行大量酶切，琼脂电泳后，在紫外光下分别切下聚磷基因和载体基因条带，进行胶回收，再用T4DNA Ligase将两个回收产物连接在一起构成表达载体。pQE-30a载体的多克隆位点含有限制性内切酶BamHⅠ、SalⅠ、HindⅢ和PstⅠ的酶切位点，pET-28a载体中则含有NcoⅠ和XhoⅠ的酶切位点。故而将基因ppk44和ppk73分别与pQE-30a酶连，构成表达载体pQE30a-ppk44和pQE30a-ppk73，而将基因ppk33与pET-28a的酶连构成表达载体pET28a-ppk33。转化后分别挑取表达子，提取质粒并进行验证。将验证正确的阳性重组质粒菌株送往上海生工公司测序，测序结果证明，3个基因的表达载体均构建正确。
为保证重组质粒的有效表达，将pET28a-ppk33的质粒转入BL21(DE3)中，获得工程菌株BL21(DE3)/pET28a-ppk33;而将pQE30a-ppk44和pQE30a-ppk73分别转入M15中，获得相应的工程菌株M15/pQE30a-ppk44和M15/pQE30a-ppk73。IPTG是乳糖的类似物，可与阻遏蛋白结合成复合物，而使阻遏蛋白构象发生改变，阻遏蛋白就不能再与O基因结合，从而促进基因表达。IPTG诱导剂被广泛应用于诱导表达系统，但也存在一定的毒性。诱导剂的含量和诱导温度对目的基因的表达均有不同程度的影响。为了使重组表达子的目的蛋白表达量最大化，且获得可溶性蛋白，设计了多组不同诱导温度和IPTG浓度梯度。
SDS-PAGE电泳分析表明，3个表达菌株均能在IPTG浓度0.8mM、37℃培养条件下大量表达。保持IPTG浓度不变，改变诱导温度为16℃、20℃和28℃，分时间取菌液提取蛋白，利用SDS-PAGE电泳检测，在16℃下诱导培养18h时相比于pQE-30a空载菌株的表达结构，M15/pQE30a-ppk44和M15/pQE30a-ppk73均在75kDa左右有明显的蛋白条带出现，表明3个表达菌株能在低温下将目的蛋白表达至上清中，为可溶性蛋白。
以含pET-28a或pQE-30a的E.coli菌株为对照，将表达菌株分别接种于合成废水培养基中，37℃好养培养，加入IPTG诱导剂10h后采集菌液，测定表达菌株和对照菌株的菌液上清磷含量，并分别统计各菌株的去磷量和聚磷率，结果表达菌株BL21(DE3)/pET28a-ppk33的去磷量是其相应对照菌株的3.3倍，表达菌株M15/pQE30a-ppk44是其对应对照菌株去磷量的7倍，10h聚磷率高达70%，而对照菌株聚磷率仅为10%。表明相应的ppk基因在E.coli中过量表达，导致菌体积聚poly P，从而使培养基中大量的磷酸盐得到有效去除。