申请日2012.06.20
公开(公告)日2012.10.10
IPC分类号C12Q1/68; C12N15/11
摘要
本发明公开了一种测污泥中四环素类抗性基因tetB的引物序列及方法，引物序列包括正向引物和反向引物，其碱基序列为：正向引物：GGCAGGAAGAATAGCCACTAA;反向引物：AGCGATCCCACCACCAG。检测污泥中四环素类抗性基因tetB的方法包括：(1)提取待测污泥样品中的DNA，以提取的DNA为模板，用所述的正向引物和反向引物进行定量PCR扩增并记录下达到荧光阈值时的循环数;(2)将步骤(1)中得到的循环数参照定量PCR测定目的基因tetB质粒标准品的标准曲线，得到待测污泥样品中四环素类抗性基因tetB的含量。本发明的引物序列及检测方法实现了污泥中四环素类抗性基因tetB的快速精确定量检测。
权利要求书
1.一种检测污泥中四环素类抗性基因tetB的引物序列，其特征在于， 包括正向引物和反向引物，其碱基序列为：
正向引物：GGCAGGAAGAATAGCCACTAA;
反向引物：AGCGATCCCACCACCAG。
2.一种利用权利要求1所述的引物序列检测污泥中四环素类抗性基 因tetB的方法，其特征在于，包括：
(1)提取待测污泥样品中的DNA，以提取的DNA为模板，用权利 要求1所述的正向引物和反向引物进行定量PCR扩增并记录达到荧光阈 值时的循环数;
(2)将步骤(1)中得到的循环数参照定量PCR测定目的基因tetB 质粒标准品的标准曲线，得到待测污泥样品中四环素类抗性基因tetB的含 量。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的定量PCR的反 应体积为15ul：2ul DNA溶液，7.5ul SYBR Premix Ex Taq溶液，0.3ul ROX Reference溶液，0.3ul浓度为10mM的正向引物，0.3ul浓度为10mM 的反向引物，4.6ul ddH2O。
说明书
一种检测污泥中四环素类抗性基因tetB的引物序列及方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种检测污泥中四环素类抗性 基因tetB的引物序列及方法。
背景技术
抗生素是人类20世纪最重要的医学发现之一，然而近年来，抗生素 在人类医疗以及养殖业方面滥用情况越发严重，越来越多的抗生素进入环 境已成为不争的事实。环境中抗生素的存在除了导致化学药物污染外，更 诱导细菌产生的抗生素抗性基因污染，并由此可能引发的生态问题亦令人 关注。因为抗生素在环境中的浓度增长所带来的抗生素选择性压力的加 大，将加速抗生素耐药性细菌以及抗生素抗性基因在环境中的出现和传 播。同时，也增加了人类致病菌获得抗生素抗性基因、对抗生素产生抗性 的几率。因此，抗生素抗性基因的存在及传播将严重威胁人类的健康。
抗生素抗性基因可以在环境中长期残留，并且可以在不同环境介质中 的迁移、转化。抗生素的大量使用，使水环境不仅成为耐药基因的储库， 也成为耐药基因扩展和演化的媒介，因此需要特别加强水环境中抗生素抗 性基因的环境行为研究。污水处理厂因为进水中包含重金属、抗生素、洗 涤剂、季铵盐等物质，这些物质也可以协同或交叉引起微生物抗药性，且 污水处理厂微生物分布密集，极易诱导微生物产生抗性基因;而污水处理 厂出水被认为是受纳水体中抗生素抗性基因的主要来源。并且国外相关研 究指出，污水处理厂污泥中可以检出多种四环素类抗性基因，抗性基因不 仅种类丰富，相对含量也较高。
目前国内对于抗生素抗性基因的危害性还未给予应有的重视，有关抗 生素抗性基因的研究大多集中于临床微生物中抗性基因的定性分析方面， 近年来有一些研究利用普通PCR-DGGE等技术来对环境中的四环素抗性 基因进行直接检测，也有许多关于微生物对四环素和其他类抗生素表型抗 性的研究。
然而目前研究所采用的方法只能研究可培养微生物的抗性，但是这些 检测手段缺少定量结果，对不可培养微生物的抗性基因也无法检测。
实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用 荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进 行定量分析的方法。因此使用荧光定量PCR技术可以从数量上更为直观 地探讨环境中抗性基因的变化，而且由于这种方法不依赖于微生物培养， 因此也能检测不可培养微生物所携带的抗性基因，使最终得到的量化结果 更为全面和可信。因此采用实时荧光定量PCR(Real-time quantitive PCR) 技术作为研究手段，从数量上更为直观地探讨环境中抗性基因的变化，从 而寻找有效措施阻止抗生素抗性基因的产生及其在环境中的广泛传播是 一项十分紧迫的任务。
发明内容
本发明提供了一种测污泥中四环素类抗性基因tetB的引物序列及方 法，实现污泥中四环素类抗性基因tetB的快速精确定量检测。
一种检测污泥中四环素类抗性基因tetB的引物序列，包括正向引物和 反向引物，其碱基序列为：
正向引物：GGCAGGAAGAATAGCCACTAA;
反向引物：AGCGATCCCACCACCAG。
本发明还提供了一种利用所述的引物序列检测污泥中四环素类抗性 基因tetB的方法，包括：
(1)提取待测污泥样品中的DNA，以提取的DNA为模板，用所述 的正向引物和反向引物进行定量PCR扩增并记录达到荧光阈值时的循环 数;
(2)将步骤(1)中得到的循环数参照定量PCR测定目的基因tetB 质粒标准品的标准曲线，得到待测污泥样品中四环素类抗性基因tetB的含 量。
所述的定量PCR的反应体积为15ul：2ul DNA溶液，7.5ul SYBR Premix Ex Taq溶液，0.3ul ROX Reference溶液，0.3ul浓度为10mM的 正向引物，0.3ul浓度为10mM的反向引物，4.6ul ddH2O。
所述DNA的提取采用FastDNA Spin Kit for Soil试剂盒，用Fast DNA Spin Kit for soil试剂盒提取的DNA样品可以保存半年甚至多年，有利于 将不同季节、不同地区污泥样品进行对比分析。将反应体系减少为15ul， 大大节约了检测成本，使得高通量检测成为可能。
步骤(2)中所述标准曲线的标准品的制备方法为：利用所述的正向 引物和反向引物做普通PCR扩增;扩增序列用商业化凝胶回收试剂盒纯 化;纯化后的序列接入载体并转化入感受态细胞;将感受态细胞涂于含有 氨苄青霉素、X-gal和IPTG的LB固体培养基上培养12-16h，通过蓝白斑 筛选挑取白色重组菌斑，挑选白色阳性克隆子用LB培养液扩大培养;待 菌液混浊后，取1ml菌液送公司测序插入基因片断，其余3-4ml菌液用来 提取质粒;使用微量核酸蛋白质分析仪检测提取质粒的含量及纯度，确保 质粒DNA的A260/A280比值在1.8左右。符合要求的质粒作为标准品绘 制标准曲线。
本发明的有益效果：
(1)本发明的方法不依赖于微生物培养，与传统微生物培养法相比， 也能检测不可培养微生物所携带的抗性基因，使最终得到的量化结果更为 全面和可信，并且用Fast DNA Spin Kit for soil试剂盒提取的DNA样品可 以保存半年甚至多年，有利于将不同季节、不同地区污泥样品进行对比分 析;
(2)通过普通PCR反应，可以确定污泥中四环素类抗性基因tetB的 存在与否;通过荧光定量PCR反应，可以确定污泥中四环素类抗性基因 tetB含量，为污泥处置提供技术指导;
(3)优化了定量PCR实验的反应液体系，对于反应孔壁上残留液， 通过多次混匀离心以及添加ROX校准染料克服移液误差，将反应体系减 少为15ul，而一般实验需要20ul甚至更多的反应液才能得出准确的数据， 大大节约了检测成本，使得高通量检测成为可能。