申请日2012.05.16
公开(公告)日2013.12.04
IPC分类号C12N1/20; C02F101/34; C12R1/01; C02F3/34
摘要
本发明公开了从焦化废水中筛选分离得到的一株苯酚降解细菌Diaphorobacter sp.菌株P2。16S rDNA序列相似性分析表明P2菌株与已知Diaphorobacter 16S rDNA序列同源性为99%。Diaphorobacter P2可降解高达1000mg/L的苯酚;复合重金属对P2菌株降酚效率的影响大小依次为：Zn2+>Mn2+>Pb2+，pb2+对Diaphorobacter P2降酚效率没有显著影响;在焦化废水与蒸馏水分别以1∶2和1∶1体积比配制的废水中接种P2，酚类物质可在4天内被完全降解。本发明为焦化废水酚污染的生物处理和开发生物修复菌剂提供材料和理论依据。
权利要求书
1.一株Diaphorobacter sp菌株，其特征在于，该菌株属于Diaphorobacter属，命名为P2 菌株。
2.如权利要求书1所述的Diaphorobacter P2菌株，该菌株的形态特征：
在固体培养基上划线分离单菌落，培养后形成乳白色半透明，圆形的菌斑，边缘整齐， 菌落略隆起，表面光滑，质地湿润，易挑起，电镜扫描观察其呈杆状。
3.如权利要求书1所述的DiaphorobacterP2菌株，其特征在于，所述菌株的16S rDNA序 列如SEQ ID NO.1所示。
4.如权利要求书1所述的Diaphorobacter P2菌株的耐酚浓度达1200mg/L，其在无机盐液 体培养基中可降解1087mg/L苯酚，625mg/L苯酚可在24h完全降解，重金属Pb2+对菌 株降酚效率没有显著影响。
5.如权利要求书1所述的DiaphorobacterP2菌株可应用于焦化废水酚污染物的生物处理。
说明书
一株Diaphorobacter菌在焦化废水除酚中的应用
技术领域：
本发明涉及一株降解苯酚的菌株Diaphorobacter P2，该菌株可耐重金属Mn、Zn和Pb等，具有降解吡啶和邻甲酚的能力，特别涉及到焦化废水酚类有机污染物的生物处理。
背景技术：
苯酚是重要的有机化工原料，在合成纤维、合成橡胶、石料、医药、农药、香料、染料以及涂料等方面具有广泛的应用。同时也是煤气洗涤、炼焦、合成氨、造纸、木材防腐和化工行业废水的主要污染物，其中炼焦产生的废水是典型的难降解工业废水。焦化废水含酚类、苯系物、胺类、烷烃、喹啉等有机物，同时含有硫化物、氰化物、油类和重金属(铜、锰、锌、镍、铅、镉等)，苯酚类及其衍生物在焦化废水有机物质量分数中所占比例最大约为60%。苯酚属高毒物质，对皮肤、粘膜有强烈的腐蚀作用，可抑制中枢神经或损害肝、肾功能，高浓度酚可使蛋白质凝固及引起组织损伤、坏死。由于苯酚具有致癌、致畸、致突变的潜在毒性，各国都相继提出了把苯酚列为水中优先控制污染物。我国“水中优先控制污染物黑名单”列出的68种有毒化学污染物中也包括苯酚、间甲酚等6种酚类化合物。焦化废水未经处理，大量排放，造成严重的环境污染，严重危害人体健康和生态环境。因此，如何有效地处理焦化废水是环境污染防治领域迫切解决的问题。
目前国内外处理含酚废水的主要方法有物理、化学和生物三种途径。生物法及其酚类生物处理主要是利用微生物的新陈代谢作用，降解水中的酚类化合物，将其转化为无机物，使废水得到净化。微生物与化学、物理法相比较因处理成本低、效率高、易操作、无二次污染等优点，逐渐被重视和推广用于处理含酚废水。为了取得高效的生物处理效果，分离筛选高效降酚菌株处理含酚废水已成为治理含酚废水的必然要求。已经分离鉴定出多种降酚微生物菌株如红球菌、克雷伯菌、嗜热菌、芽孢杆菌、酵母菌、Corynebacterium、不动杆菌、Micrococcus、产碱杆菌、沙雷氏菌、假单胞菌等。然而，不同的降酚菌株来源不同，对不同废水的适应性不同，在生物处理焦化废水中的应用不多。另一方面，焦化废水是复杂的混合体系，往往同时含有多种有机污染物和高浓度的重金属离子，这些物质会严重抑制微生物对酚类的生化降解。为此，分离筛选出能降酚和多种有机污染物的耐或抗高浓度重金属离子的菌株，对于生物处理焦化废水具有重要的应用前景。
发明内容：
本发明的目的在于提供一株可高效降解苯酚的菌株，为焦化废水的治理提供理论基础和技术支持。
本发明人从焦化厂二次沉淀池采集活性污泥，经过富集驯化及筛选，得到一株高效降解苯酚的菌株，经鉴定该菌株16S rDNA序列与已知Diaphorobacter sp.16S rDNA序列同源性为99%，命名为P2。
本发明中，富集驯化、筛选和分离Diaphorobacter P2菌株的过程为：取5ml摇匀的样品废水装于含有100ml富集培养基的锥形瓶中置摇床中震荡培养(37℃，180r/min)，待培养基变浑浊，在无菌操作条件下取出5ml培养基加入到含有100ml的新鲜富集培养基中培养。培养基浑浊后，取出2ml转接到含苯酚浓度为100mg/L的新鲜富集培养基中培养，富集瓶混浊后，取2ml培养液转接到苯酚浓度为200mg/L的液体培养基中培养。依次类推，逐级提高苯酚浓度，在300～400mg/L的条件下进行富集培养。将经过苯酚浓度为400mg/L的富集培养基富集后的菌体稀释成10-5、10-6、10-7、10-8四个梯度，分别涂布于苯酚浓度为400mg/L的富集培养基平板上，每个稀释度重复三次，同时倒置于生物培养箱中于30℃条件下恒温培养。待出现菌斑后，挑取富集培养基平板上的单菌落于苯酚浓度为400mg/L的无机盐培养基平板上反复划线进行纯化，然后将分离纯化后的菌株加入到含苯酚浓度为400mg/L的无机盐液体培养基中培养，培养基浑浊后，再依次转接至苯酚浓度分别为400、600、800、1000mg/L的无机盐培养基中。
所述液体富集培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，具体配方：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，去离子水1000ml，pH 7.0～7.2，苯酚(根据需要量加入)，固体培养基是在此培养基中加入15～20g琼脂。无机盐液体培养基，具体配方：KH2PO4 0.5g，NH4NO3 1.0g，MgSO40.2g，CaCl2 0.2g，FeSO4·7H2O 0.01g，MnSO4·H2O 0.01g，苯酚(根据需要量加入)，加蒸馏水定容至1L，固体培养基是在此培养基中加入15～20g琼脂。调节pH值所用的NaOH浓度为2mol/L，HCl浓度为0.5mol/L。