申请日2013.09.10
公开(公告)日2014.03.26
IPC分类号C02F3/34; C02F101/34; C12R1/645; C12N1/14
摘要
本发明公开了利用米曲霉菌体去除废水中没食子酸工艺技术，涉及生物工程领域。即利用米曲霉作为出发菌株，经过液体摇瓶培养、液体菌体扩大培养、获得米曲霉菌体，利用该菌体去除废水中没食子酸的工艺。采用此工艺技术没食子酸去除率可以达到70～100%。
权利要求书
1.一种米曲霉降解没食子酸工艺技术，其特征在于按照下述步骤进行：以米曲霉为出发菌株，进行试管扩大培养、液体摇瓶培养、菌体液体扩大培养，离心收集菌体，然后用菌体去除废水中没食子酸。
2.根据权利要求1所述的一种米曲霉降解没食子酸工艺技术，其特征在所用的菌种是米曲霉的任意一株菌种。
3.根据权利要求1所述的一种米曲霉降解没食子酸工艺技术，其特征在所适用的废水是任意一种含没食子酸的废水，如发酵法生产没食子酸的废液、从植物中提取没食子酸的废液或者以没食子酸为原料合成其他产品的废液。
4.根据权利要求1所述的一种米曲霉降解没食子酸工艺技术，其特征在其中所述的试管扩大培养中的扩大培养基为马铃薯蔗糖培养基。
5.根据权利要求1所述的一种米曲霉降解没食子酸工艺技术，其特征在其中所述的液体摇瓶培养中和菌体液体扩大培养中的液体摇瓶培养基和液体菌体培养基均为：葡萄糖5～30克/升，蛋白胨0～5克/升，酵母膏0～5克/升，硫酸镁0.2～1克/升，吐温-80 0.5～10克/升，磷酸二氢钾2～9克/升，pH5～8，120～140℃灭菌20～40分钟。
6.根据权利要求1所述的一种米曲霉降解没食子酸工艺技术，其特征在其中所述的摇瓶培养工艺条件为，接种3-5块米曲霉试管斜面菌体(5×5mm)于装有40～120 mL培养基的250mL三角瓶中，在转速：150转/分，25～35℃，培养24～72小时。
7.根据权利要求1所述的一种米曲霉降解没食子酸工艺技术，其特征在其中所述的菌体培养工艺为，按1～20%(体积比)的接种量将摇瓶培养种子液接种到液体菌体扩大培养工艺为，在温度25～35℃，搅拌转速50～200转/分，通气量0.2～2：1体积/体积/分钟(通气气体体积/发酵液体积/分钟)，培养18～72小时;培养液经过3000～6000rpm离心5～20分钟，得到米曲霉菌体。
8.根据权利要求1所述的一种米曲霉降解没食子酸工艺技术，其特征在所述的用菌体去除废水中没食子酸的工艺为：上述米曲霉菌体与含有0.5～10克/升没食子酸的废水(通过真空浓缩或稀释调节没食子酸浓度)按1：10～50(质量/体积)混合，在温度25～60℃，搅拌转速50～200转/分，通气量0.2～2：1体积/体积/分钟(通气气体体积/发酵液体积/分钟)，反应3～15小时，即可去除没食子酸。
说明书
利用米曲霉菌体去除废水中没食子酸工艺技术
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，特指利用米曲霉菌体去除含有没食子酸的废水中的没食子酸。将原废水浓缩或稀释至没食子酸含量在0.5～10克/升后，投入米曲霉菌体，通气搅拌反应去除没食子酸。应用此工艺没食子酸的去除率可达到60～100%。
背景技术
天然水体中溶解性有机物(Dissolved organic matter，DOM)的主要成分是天然有机酸(Natural organic acids，NOA)，而天然有机酸中15%一30%是亲水性小分子有机酸，没食子酸作为自然界普遍存在的亲水性小分子有机酸，在饮用水净化过程中会带来以下问题：1)影响水的色度、口感和气味：2)在氯消毒过程中形成消毒副产物(Disinfection byproducts，简称DPBs)，如三氯甲烷、卤乙酸类，它们在水体中和氯结合后可以对生物体尤其是人类肝、肾和中枢神经系统造成损害，有致癌、致畸、致突变作用;3)在后续水的深度处理过程中会容易导致膜的污染。没食子酸也是食品加工、日化、医药生产过程中所用的重要原料，生产过程中所排废水含有大量没食子酸，其在水体中会分解产生有机酸及沼气等，消耗水中溶解氧，致使鱼虾等水生生物缺氧而死亡;导致水体COD升高等，由此带来一系列的水生态环境问题。因此高效降解水体中没食子酸成为水污染控制的一个重要方面。
目前关于含有没食子酸废水的处理专利有几项，但是主要是水洗或碱提取等方法，如专利没食子酸生产废渣回收处理方法(申请号200610086067.7),保护了废渣在90~100度下两次水洗，两次压榨的方法回收没食子酸的方法;专利没食子酸母液回收处理工艺(专利号200910226622.5)保护了利用碱提取没食子酸酸，然后调节pH8.0-9.0沉淀得到没食子酸粗品的工艺;专利没食子酸生产废水、废渣、废碳回收处理新技术(专利申请号201210469098.6)公开了生产没食子酸的废渣、废炭采用逆流二次水洗一次挤压法回收没食子酸工艺;专利一种处理没食子酸的粗制废液的方法(申请号2010136553.1)以及文章“Fenton反应-中和-生物法处理没食子酸粗制废液”(杂志“水处理技术”2010年，36卷第9期，pp106-109)，公开了没食子酸粗制废液经过催化氧化、调节pH沉淀、活性炭吸附、最后经过稀释曝气处理的方法，这些方法都存在处理不完全，或用大量的水稀释。
本发明人经过深入的研究，摸索出一种利用米曲霉(Aspergillus oryzae)菌体，在通气和搅拌反应一段时间去除废水中没食子酸工艺，该工艺时间短，去除率高。
发明内容
本发明提供的是米曲霉(Aspergillus oryzae)降解废水中没食子酸的生物技术。废水经过米曲霉降解后，其没食子酸去除率可到达60~100%。
本发明一种米曲霉降解没食子酸工艺技术，按照下述步骤进行：以米曲霉为出发菌株，进行试管扩大培养、液体摇瓶培养、菌体液体扩大培养，离心收集菌体，然后用菌体去除废水中没食子酸。
本发明所用的菌种是米曲霉任何一种菌种，如中国普通微生物菌种保藏管理中心(CCGMC)、中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)、中国工业微生物菌种保藏管理中心 (CICC)、中国医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC)、国家兽医微生物菌种保藏中心 (CVCC)和抗生素菌种保藏管理中心等等保藏的菌种。
本发明所适用的废水是任意一种含没食子酸的废水，如发酵法生产没食子酸的废液、从植物中提取没食子酸的废液或者以没食子酸为原料合成其他产品的废液。
其中所述的试管扩大培养中的试管扩大培养基为马铃薯蔗糖培养基(诸葛健、王正祥主编的“工业微生物实验技术手册”，1994，367页。
其中所述的液体摇瓶培养中和菌体液体扩大培养中的液体摇瓶培养基和液体菌体培养基均为：葡萄糖5～30克/升，蛋白胨0～5克/升，酵母膏0～5克/升，硫酸镁0.2～1克/升，吐温-80 0.5～10克/升，磷酸二氢钾2～9克/升，pH5～8，120～140℃灭菌20～40分钟;其中所述的摇瓶培养工艺条件为，接种一环米曲霉试管斜面孢子(1×106)于装有40～120 mL培养基的250mL三角瓶中，在转速：150转/分，25～35℃，培养24～72小时;其中所述的菌体培养工艺为，按1～20%(体积比)的接种量将摇瓶培养种子液接种到液体菌体扩大培养工艺为，在温度25～35℃，搅拌转速50～200转/分，通气量0.2～2：1体积/体积/分钟(通气气体体积/发酵液体积/分钟)，培养18～72小时;培养液经过3000～6000rpm离心5～20分钟，得到米曲霉菌体。
本发明所述的用菌体去除废水中没食子酸的工艺为：上述米曲霉菌体与含有0.5～10克/升没食子酸的废水(通过真空浓缩或稀释调节没食子酸浓度)按1：10～50(质量/体积)混合，在温度25～60℃，搅拌转速50～200转/分，通气量0.2～2：1体积/体积/分钟(通气气体体积/发酵液体积/分钟)，反应3～15小时。
使用该工艺废水降解后，没食子酸去除率可达到70-100%。
根据本发明所述的液体菌体扩大培养工艺，结合本领域的基本知识，可以根据生产需要，增加二级、三级甚至四级菌体罐，进一步扩大生产规模，以进行工业化生产。二级、三级甚至四级种子罐采用的培养基与摇瓶培养基和菌体液体扩大培养基相同，接种量为5～20%，培养条件同于液体菌体扩大培养条件。
具体实施方式
根据此工艺采用的没食子酸测定方法为：精密称取没食子酸对照品10.3 mg，置于100 mL 烧杯中，用色谱级甲醇溶解，并定容至100mL 容量瓶中， 配制成10.3mg/mL的标准储备液。临用时用0.45μm微孔滤膜过滤，控制进样量为2，4，6，8，10μl，利用高效液相色谱仪(HIMADZU(岛津) LC-20AT)测定没食子酸含量。色谱柱为AlltimaTMC18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)。测定条件为流动相：甲醇：0.1%磷酸溶液=10：90;柱温：30℃，流速：0.8 mL/min，检测波长：270 nm。以进样量为横坐标(X)，以相应的峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归，求得没食子酸浓度与峰面积的线性回归方程。吸取样品液(降解前和降解过程中以及降解后)的上清液少量，用0.45μm微孔滤膜过滤，按上述色谱条件分别测定峰面积，采用外标峰面积根据上述求得的没食子酸浓度与峰面积的回归方程计算没食子酸含量。
没食子酸去除率Re按下列公式(1)计算：
(1)
式中，Rt为t时间没食子酸的去除率;C0 (mg/L) 为0小时的没食子酸浓度;Ct (mg/L ) 为吸附t小时没食子酸的浓度。
为了进一步阐述本发明的技术方案所涉及的材料及工艺，给出了以下实施例，但是这些实施例不以任何形式限制本发明的范围。
实施例1
1. 试管斜面菌种的制作
在新配置的马铃薯蔗糖培养基(诸葛健、王正祥主编的“工业微生物实验技术手册”，1994，367页)中接入一环米曲霉(Aspergillus oryzae)菌种(中国普通微生物菌种保藏管理中心CCGMC3.5232)，26℃，培养时间50小时;4℃保存备用。
2. 液体摇瓶培养菌种的制作
精确称取葡萄糖5克，蛋白胨0克，酵母膏5克，硫酸镁0.2克，吐温-80 0.5克，磷酸二氢钾2克，水1000 mL, pH 5，分装250mL三角瓶，每瓶50克，共20瓶，120 ℃灭菌 40分钟;冷却后，每瓶接入一环4℃保存的米曲霉菌种(1×106个孢子)，在25℃，150转/分，培养 72小时;
3. 菌体液体扩大培养
精确称取葡萄糖50克，蛋白胨0克，酵母膏50克，硫酸镁2克，吐温-80 5克，磷酸二氢钾20克，水10L，装于15L的种子罐中，120℃灭菌20分钟;灭菌冷却后，在温度25 ℃，搅拌转速50 转/分，通气量0.2 ：1体积/体积/分钟(通气气体体积/发酵液体积/分钟)，培养 72小时;培养液经过3000rpm离心20分钟，得到米曲霉菌体。
4. 去除废水中没食子酸
以五倍子为原料，采用高温高压和碱提取没食子酸的废液经过浓缩，没食子酸浓度为10克/L的废液1000L，菌体与废液按1：50(质量/体积)混合，在温度25℃，搅拌转速60转/分，通气量0.3：1体积/体积/分钟(通气气体体积/发酵液体积/分钟)，反应3小时后，没食子酸去除率达到71.3%。
实施例2
1. 试管斜面菌种的制作
在新配置的马铃薯蔗糖培养基(诸葛健、王正祥主编的“工业微生物实验技术手册”，1994，367页)中接入一环米曲霉菌种(中国农业微生物菌种保藏管理中心ACCC30155)，30℃，培养时间100小时;7℃保存备用。
2. 液体摇瓶培养菌种的制作
精确称取葡萄糖150克，蛋白胨25克，酵母膏25克，，硫酸镁0.4克，吐温-80 4克，磷酸二氢钾5克，水10 L, pH 6，分装250mL三角瓶，每瓶100克，共100瓶，130℃灭菌30分钟;冷却后，每瓶接入一环7℃保存的米曲霉菌种(1×106个孢子)，在30℃，150转/分，培养50小时;
3. 菌体液体扩大培养
精确称取葡萄糖2000克，蛋白胨250克，酵母膏250克，硫酸镁60克，吐温-80 60克，磷酸二氢钾400克，水100L，装于130L的种子罐中，130℃灭菌30分钟;冷却后，在温度30℃，搅拌转速125转/分，通气量1：1体积/体积/分钟(通气气体体积/发酵液体积/分钟)，培养50小时;培养液经过4500rpm离心13分钟，得到米曲霉菌体。
4. 去除废水中没食子酸
以五倍子为原料通过黑曲霉发酵制备没食子酸的废母液，稀释至没食子酸含量为5克/L的废液1000L，菌体与废液按1：30(质量/体积)混合，在温度45℃，搅拌转速120转/分，通气量1：1体积/体积/分钟(通气气体体积/发酵液体积/分钟)，反应7小时后，没食子酸去除率达到87.5%。
实施例3
1. 试管斜面菌种的制作
在新配置的马铃薯蔗糖培养基(诸葛健、王正祥主编的“工业微生物实验技术手册”，1994，367页)中接入一环米曲霉菌种(中国工业微生物菌种保藏管理中心 CICC2001)，35℃，培养时间144小时;10℃保存备用。
2. 液体摇瓶培养菌种的制作
精确称取葡萄糖300克，蛋白胨50克，酵母膏0克，硫酸镁10克，吐温-80 100克，磷酸二氢钾90克，水10L, pH7.5，分装250mL三角瓶，每瓶120 mL，共80瓶， 140℃灭菌20分钟;冷却后，每瓶接入一环10℃保存的米曲霉菌种(1×106个孢子)，在35℃，150转/分，培养72小时;
3. 一级菌体液体扩大培养
精确称取葡萄糖1500克，蛋白胨250克，酵母膏0克，硫酸镁50克，吐温-80 500克，磷酸二氢钾450克，水50L，装于70L的一级种子罐中， 140℃灭菌40分钟;灭菌冷却后，在温度35℃，搅拌转速200转/分，通气量2：1体积/体积/分钟(通气气体体积/发酵液体积/分钟)，培养50小时;
4. 二级菌体液体扩大培养
精确称取葡萄糖15000克，蛋白胨2500克，酵母膏0克，硫酸镁500克，吐温-80 5000克，磷酸二氢钾4500克，水500L，装于700L的二级种子罐中， 140℃灭菌40分钟;灭菌冷却后，在温度35℃，搅拌转速200转/分，通气量2：1体积/体积/分钟(通气气体体积/发酵液体积/分钟)，培养18小时;培养液经过6000rpm离心5分钟，得到米曲霉菌体。
5. 去除废水中没食子酸
以微晶纤维素、没食子酸为原料,在催化剂的作用下,采用直接酯化法合成没食子酸微晶纤维素酯的废液，稀释至没食子酸含量为0.5克/L的废液1000L，菌体与废液按1：10(质量/体积)混合，在温度60℃，搅拌转速200转/分，通气量2：1体积/体积/分钟(通气气体体积/发酵液体积/分钟)，反应15小时后，没食子酸去除率达到100%。