申请日2013.10.24
公开(公告)日2016.01.20
IPC分类号C12N15/63; C12N1/21; C12N15/66; C02F3/34; C12R1/19
摘要
本发明公开了一种用于清除工业废水汞污染的重组质粒、构建方法、重组工程菌及应用，所述重组质粒是在质粒pET28a的基础上插入烟草叶绿体rrn16基因强启动子、大肠杆菌T7噬菌体基因10的5’UTR序列中的核糖体结合位点保守序列、烟草叶绿体rps16基因的3’端非编码区、产气肠杆菌聚磷激酶基因ppk和假单胞菌K-62菌株去掉merA、merG后的mer操纵子构建而成。本发明通过merT-merP将废水中的有机汞和无机汞转运到细菌细胞内，通过merB1和merB2将有机汞降解为二价汞，通过ppk将二价汞螯合在细胞内，降低汞对细菌细胞的毒性，将废水中的汞积累在细菌细胞内，通过收集重组工程菌菌体清除废水中的汞污染。
权利要求书
1.一种用于清除工业废水汞污染的重组质粒，其特征在于：所述重组质粒是在质粒pET28a的基础上插入烟草叶绿体rrn16基因强启动子、大肠杆菌T7噬菌体基因10的5’UTR序列中的核糖体结合位点保守序列、烟草叶绿体rps16基因的3’端非编码区、产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)聚磷激酶基因ppk和假单胞菌(Pseudomonas)K-62菌株去掉merA、merG后的mer操纵子构建而成;所述mer操纵子为merT-merP-merB1-merB2;所述重组质粒含有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。
2.一种如权利要求1所述的用于清除工业废水汞污染的重组质粒的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)根据假单胞菌K-62菌株质粒pmr26和pmr28，合成人工操纵子merT-merP-merB1-merB2，将其与质粒pET28a进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5a，筛选阳性克隆过夜培养，提取质粒，酶切和测序鉴定结果与预期相符的质粒，命名为p1;
(2)以产气肠杆菌DNA为模板，设计引物，扩增ppk基因;将ppk基因和质粒p1酶切后进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5a，筛选阳性克隆过夜培养，提取质粒，酶切和测序鉴定结果与预期相符的质粒，命名为p2;
(3)设计引物，扩增含有烟草叶绿体rrn16基因强启动子和大肠杆菌T7噬菌体基因10的5’UTR序列中的核糖体结合位点保守序列;
(4)将含有烟草叶绿体rrn16基因强启动子和大肠杆菌T7噬菌体基因10的5’UTR序列中的核糖体结合位点保守序列和质粒pET28a酶切后进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5a，筛选阳性克隆过夜培养，提取质粒，酶切和测序鉴定结果与预期相符的质粒，命名为p3;
(5)以质粒p2为模板，设计引物，扩增人工操纵子merT-merP-merB1-merB2-ppk;将merT-merP-merB1-merB2-ppk和质粒p3酶切后进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5a，筛选阳性克隆过夜培养，提取质粒，酶切和测序鉴定结果与预期相符的质粒，命名为p4;
(6)以烟草叶绿体DNA为模板，设计引物，扩增rps163’端非编码区基因序列;将rps163’端非编码区基因与质粒p4酶切后进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5a，筛选阳性克隆过夜培养，提取质粒，酶切和测序鉴定结果与预期相符的质粒即为用于清除工业废水汞污染的重组质粒。
3.一种用于清除工业废水汞污染的重组工程菌，其特征在于：由权利要求1所述的重组质粒转化大肠杆菌BL21得到。
4.一种如权利要求3所述的重组工程菌在清除工业废水汞污染方面的应用。
说明书
一种用于清除工业废水汞污染的重组质粒、构建方法、重组工程菌及应用
技术领域
本发明涉及一种用于清除工业废水汞污染的重组质粒，同时还涉及该重组质粒的构建方法、包含该重组质粒的重组工程菌及该重组工程菌的应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
土壤是人类赖以生存的主要自然资源之一，也是人类生态环境的重要组成部分。随着工业、城市污染的加剧和农用化学物质种类、数量的增加，土壤重金属污染日益严重。汞是其中一种主要的重金属污染物。农用土壤重金属污染主要来自于污水灌溉。据我国农业部进行的全国污灌区调查，在约140万公顷的污水灌区中，遭受重金属污染的土地面积占污水灌区面积的64.8%，其中轻度污染的占46.7%，中度污染的占9.7%，严重污染的占8.4%。因此，在废水排出工厂前进行去汞处理，对于保障人类身体健康非常重要。
废水中的汞主要有三种形态：金属汞、无机汞和有机汞，其中有机汞的毒性最大。运用生物方法对被汞污染的废水进行处理能够将对周围环境的影响降低到最小程度。在目前已知的对汞具有耐受性的生物中，假单胞菌(Pseudomonas)K-62菌株对汞的耐受性最强，其对汞的耐受性比大肠杆菌高1000倍左右。该菌具有对汞极强的耐受能力主要起因于该菌细胞内的两个质粒：pmr26和pmr28。pmr26含有两个抗汞操纵子mer，这两个操纵子之间相隔1kb 左右，其中一个操纵子使该菌对无机汞和有机汞都具有抗性，而另一个操纵子对有机汞则非常敏感。将这两个操纵子分别插入到质粒pBluescriptII，并命名为pmra17和pmrb01。测序后发现操纵子pmra17含有6个开放阅读框，其中5个分别被鉴定为merR、merT、merP、merA、 merB1。操纵子pmrb01含有三个开放阅读框，分别被鉴定为merR、merB2、merD。MerR是一个调节基因，对结构基因的转录进行正向调控或负向调控;merD与转录共调控的功能相关; merT、merP、merA、merB分别编码二价汞离子转运蛋白、二价汞离子外周胞质结合蛋白、汞离子还原酶和有机汞裂解酶。在多数情况下，merB紧挨着位于merA的下游。Pseudomonas K-62对有机汞的抗性主要源于merB1和merB2编码的裂解酶。MerB1负责将甲基汞转化为二价汞，merB2负责将苯基汞转化为二价汞，merA负责将二价汞还原为零价汞。转运蛋白 merT和merP负责将有机汞和无机汞运输到细胞内，并将零价汞从外周胞质中清除出去。MerG 位于merA和merB1之间，其预测的氨基酸序列含有一个引导序列，该引导序列包含一个亲水区域和一个信号肽剪切位点;该信号序列与已知的外胞周质蛋白的引导序列同源。MerG位于外胞周质上;将merG删除以后，细菌对二价汞的抗性并没有发生改变，但是对苯基汞的抗性变弱了;删除掉merG对于merA和merB编码的酶的活性也没有影响。表明merG只参与了对苯基汞的抗性，其机理可能是降低了细胞对苯基汞的通透性。
综上所述，PseudomonasK-62对汞具有极强抗性的机理是它能够将细胞内的有机汞转化为二价汞，然后将二价汞转化为零价汞，如下：
零价汞的毒性比有机汞和二价汞要小得多，而且能够挥发掉。但这并不是解决问题的根本办法，因为挥发到空气中的零价汞会重新进入汞循环，继续对人体造成危害。因此，最好的办法是将周围环境中的汞进行聚集固定，不让它们重新进入汞循环。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于清除工业废水汞污染的重组质粒。
本发明的目的还在于提供一种用于清除工业废水汞污染的重组质粒的构建方法。
本发明的目的还在于提供一种用于清除工业废水汞污染的重组工程菌。
本发明的目的还在于提供一种重组工程菌在清除工业废水汞污染方面的应用。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是提供一种用于清除工业废水汞污染的重组质粒，所述重组质粒是在质粒pET28a的基础上插入烟草叶绿体rrn16基因强启动子、大肠杆菌T7噬菌体基因10的5’UTR(OlinsandRangwala.Anovelsequenceelementderivedfrom bacteriophageT7mRNAactsasanenhanceroftranslationofthelacZgeneinEscherichiacoli.The JournalofBiologicalChemistry，1989，264(29):16973-16976)序列中的核糖体结合位点保守序列、烟草叶绿体rps16基因的3’端非编码区、产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)聚磷激酶基因ppk和假单胞菌(Pseudomonas)K-62菌株去掉merA、merG后的mer操纵子构建而成。
所述重组质粒包含有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。
本发明所采用的技术方案还在于提供一种用于清除工业废水汞污染的重组质粒的构建方法，包括以下步骤：
(1)根据假单胞菌K-62菌株质粒pmr26和pmr28，合成人工操纵子 merT-merP-merB1-merB2，将其与质粒pET28a进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5a，筛选阳性克隆过夜培养，提取质粒，酶切和测序鉴定结果与预期相符的质粒，命名为p1;
(2)以产气肠杆菌DNA为模板，设计引物，扩增ppk基因;将ppk基因和质粒p1酶切后进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5a，筛选阳性克隆过夜培养，提取质粒，酶切和测序鉴定结果与预期相符的质粒，命名为p2;
(3)设计引物，扩增含有烟草叶绿体rrn16基因强启动子和大肠杆菌T7噬菌体基因10 的5’UTR序列中的核糖体结合位点保守序列;
(4)将含有烟草叶绿体rrn16基因强启动子和大肠杆菌T7噬菌体基因10的5’UTR序列中的核糖体结合位点保守序列和质粒pET28a酶切后进行连接，连接产物转化大肠杆菌 DH5a，筛选阳性克隆过夜培养，提取质粒，酶切和测序鉴定结果与预期相符的质粒，命名为 p3;
(5)以质粒p2为模板，设计引物，扩增人工操纵子merT-merP-merB1-merB2-ppk;将 merT-merP-merB1-merB2-ppk和质粒p3酶切后进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5a，筛选阳性克隆过夜培养，提取质粒，酶切和测序鉴定结果与预期相符的质粒，命名为p4;
(6)以烟草叶绿体DNA为模板，设计引物，扩增rps163’端非编码区基因序列;将rps 163’端非编码区基因与质粒p4酶切后进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5a，筛选阳性克隆过夜培养，提取质粒，酶切和测序鉴定结果与预期相符的质粒即为用于清除工业废水汞污染的重组质粒。
本发明所采用的技术方案还在于提供一种用于清除工业废水汞污染的重组工程菌，所述重组质粒是在质粒pET28a的基础上插入烟草叶绿体rrn16基因强启动子、大肠杆菌T7噬菌体基因10的5’UTR序列中的核糖体结合位点保守序列、烟草叶绿体rps16基因的3’端非编码区、产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)聚磷激酶基因ppk和假单胞菌(Pseudomonas) K-62菌株去掉merA、merG后的mer操纵子构建而成。
所述重组工程菌的宿主为大肠杆菌。
本发明所采用的技术方案还在于提供一种重组工程菌在清除工业废水汞污染方面的应用。
本发明以烟草叶绿体rrn16基因启动子为高表达启动子，以大肠杆菌T7噬菌体基因10 的5’UTR(g10基因)核糖体结合位点保守序列为翻译增强子，烟草叶绿体rsp16基因3’端非编码区为强终止子，构建含merT-merP-merB1-merB2-ppk的重组表达系统，且将该系统整合到大肠杆菌BL21的染色体上，筛选成功转化的菌株，通过rrn16基因启动子、g10基因核糖体结合位点保守序列和rsp16基因3’端非编码区的作用提高改造的mer操纵子和ppk蛋白表达的水平，通过merT-merP将废水中的有机汞和无机汞转运到细菌细胞内，通过merB1将甲基汞降解为二价汞，通过merB2将苯基汞降解为二价汞，通过ppk将二价汞螯合在细胞内，降低汞对细菌细胞的毒性，将废水中的汞积累在细菌细胞内，通过收集重组工程菌菌体清除废水中的汞污染。
本发明的优点如下：
1、在表达基因上游添加烟草叶绿体rrn16基因强启动子，该启动子对原核生物基因的启动能力是T7启动子启动能力的6倍以上;
2、在表达基因起始密码子上游添加g10核糖体结合位点，添加该位点后，重组工程菌耐汞能力能够提高5倍左右;
3、在表达质粒中添加merB1和merB2，重组工程菌对苯基汞的耐受能力分别是现有文献报道的9倍(Hidemitsuetal.PolyphosphateproducedinrecombinantEscherichiacoliconfers mercury.FEMSMicrobiologyLetters，2002，207(2):159-164)，重组工程菌对无机汞的耐受能力也比现有文献报道的数值提高了7倍，重组工程菌对各种形态的汞耐受能力的大幅度提高，为其商业应用奠定了基础;
4、重组工程菌细胞汞积累量大幅度提高，重组工程菌细胞汞积累量是现有文献报道(Hidemitsuetal.PolyphosphateproducedinrecombinantEscherichiacoliconfersmercury. FEMSMicrobiologyLetters，2002，207(2):159-164)的5倍多;
5、重组工程菌在处理废水的时候，会随着处理进度而产生细胞团、细胞沉淀，颜色逐渐变为暗褐色，这些视觉上的变化为实际应用中的操作者带来很大方便，可以直观地通过观察来判断废水去汞的进度。