申请日2014.04.08
公开(公告)日2014.06.18
IPC分类号C07K1/32
摘要
一种从马铃薯淀粉加工废水中回收糖蛋白的方法，属于蛋白质提取技术领域。本发明利用复凝聚原理，将带有相反电荷的蛋白质和聚电解质通过静电作用力形成电中性、不溶性的复合物。以马铃薯淀粉加工过程中产生的蛋白质废水为原料，选择天然阳离子多糖壳聚糖配制成溶液，并按一定的比例加入到废水中。沉淀经过复溶，上清经过干燥处理，得到马铃薯糖蛋白产品。本发明选用天然阳离子多糖壳聚糖，选择性的回收了马铃薯糖蛋白，避免了工业上的酸热条件，最大程度保留了糖蛋白的功能性质，有效地减少了污染和提高回收蛋白附加值。此外，壳聚糖在碱性条件下不溶，可以对复合物进行分离，实现壳聚糖的循环利用，具有较大的经济效益。
摘要附图
权利要求书
1.一种从马铃薯淀粉加工废水中回收糖蛋白的方法，其特征在于：以马铃薯淀粉加工过程中产生的含蛋白质的废水为原料，选择天然阳离子多糖壳聚糖配制成一定浓度的溶液，按一定的蛋白/多糖比例加入到废水中进行复凝聚;复凝聚所得蛋白壳聚糖复合物沉淀经过复合物分离，再经蛋白质干燥，得到马铃薯糖蛋白产品;
具体步骤如下：
(1)初步处理：取马铃薯淀粉加工废液，经过0.45μm微孔滤膜过滤;并测定废液中的蛋白含量;
(2)复凝聚：取壳聚糖，溶解于质量浓度为1%的乙酸溶液中，得到质量浓度为1%的壳聚糖溶液;
取步骤(1)中初步处理的废水，在搅拌条件下按照蛋白︰壳聚糖质量比为5︰1-1︰5添加壳聚糖溶液，用pH调节剂调节pH至5-7;搅拌10min，静置30min， 25℃下以2500-4000g的速度离心10-15min，过滤;取上清液测定蛋白含量，计算蛋白回收率，所得沉淀为蛋白壳聚糖复合物;
(3)复合物分离：在步骤(2)所得的蛋白壳聚糖复合物沉淀中添加水进行复溶，其固液比为1︰5-10;充分搅拌后得到悬浮液，用pH调节剂调节pH至7.5-9.0，继续搅拌1-2h，于25℃下，以2500-4000g的速度离心10-15min，过滤;所得上清液为马铃薯糖蛋白溶液，测定蛋白含量，计算蛋白溶出率，所得沉淀为壳聚糖;
(4)蛋白质干燥：取步骤(3)所得上清液，在10~25Pa、-50~-65℃条件下真空冷冻干燥48~60h，即得回收的马铃薯糖蛋白产品。
2.根据权利要求1所述从马铃薯淀粉加工废水中回收糖蛋白的方法，其特征在于：采用Bradford法测定蛋白含量。
3.根据权利要求1所述从马铃薯淀粉加工废水中回收糖蛋白的方法，其特征在于：pH调节剂为0.1-4mol/L的盐酸或氢氧化钠溶液。
4.根据权利要求1所述从马铃薯淀粉加工废水中回收糖蛋白的方法，其特征在于：马铃薯废水中的蛋白回收率为41%-52%;马铃薯糖蛋白产品的纯度达到82%-90%，pH 7.0条件下溶解度为94%-97%，乳化活性为180-201m2/g。
说明书
一种从马铃薯淀粉加工废水中回收糖蛋白的方法
技术领域
本发明涉及一种从马铃薯淀粉加工废水中回收糖蛋白的方法，属于蛋白质提取技术领域。
背景技术
近年来，我国马铃薯淀粉的市场需求日益增大，其产业发展速度较快，在宁夏、甘肃、内蒙古等省已形成相当规模的生产基地。在产业发展的同时伴随着污染的问题，淀粉生产过程中产生大量的蛋白废液，可以促进各种杂菌包括有害菌的生长繁殖，大量消耗水中的溶解氧，导致水产养殖动物缺氧和死亡，造成严重环境污染。另一方面，马铃薯淀粉废液中富含蛋白质，其中必需氨基酸达总氨基酸含量的33%。因此，马铃薯淀粉废液的有效利用具有很高的社会、经济和环保效益。
马铃薯蛋白质按分子量的不同可以分为三大类：马铃薯糖蛋白，分子量为39-45kDa，等电点为4.5-5.2，占总蛋白的30%-40%;蛋白酶抑制剂，分子量为4-25kDa，，等电点在5.1-9.0，约占总蛋白的50%;其它蛋白约占10%-20%。马铃薯糖蛋白含有5%的中性糖和1%的氨基己糖，从其等电点看属于酸性蛋白，因此在中性和弱酸性条件下带负电。马铃薯糖蛋白是磷酸酶A2，β-1,3-葡聚糖酶，β-1,2木糖苷酶，脂酰基水解酶和酰基转移酶等一系列蛋白质的总称。目前已知该蛋白具有预防心血管系统的脂肪沉积，保持动脉血管的弹性，还可以防止肝脏中结缔组织的萎缩，保持呼吸道和消化道的润滑等多种生理功能。此外，马铃薯糖蛋白具有良好的起泡性和乳化性，具有抗氧化性，必需氨基酸含量高。使得马铃薯糖蛋白在食品、医药和生物技术方面具有非常可观的应用前景。目前已被用于合成特定的甘油一酸酯，提供食品稳定的起泡性和乳化性，制作凝胶，用作抗氧化剂，通过抗真菌性来抑制植物病原体致病疫霉菌，降低花粉甲虫幼虫的生长率，抑制玉米根虫幼虫的生长。
壳聚糖是一种阳离子型的直链氨基多糖，由甲壳素脱去乙酰基而形成。作为天然的阳离子型聚电解质，壳聚糖可与带负电的蛋白质快速沉降，可用于处理含大量可回收蛋白质的废水。壳聚糖只溶于酸性水溶液，在中性和碱性条件下不溶，利用这一性质，可将沉降的蛋白壳聚糖复合物在碱性条件下分离，得到纯净的蛋白溶液，壳聚糖可以回收进行重复使用。
带有相反电荷的蛋白质和多糖之间可以通过静电作用力形成不溶性的复合物，在环境pH高于马铃薯糖蛋白等电点的情况下，蛋白质带负电，而壳聚糖带正电，因此可以通过静电作用力相结合。与此同时，废液中的蛋白酶抑制剂类蛋白质的等电点较高，在相同pH下仍然带正电荷，无法与壳聚糖结合，从而，壳聚糖复凝聚提供了一种选择性沉淀糖蛋白的方法，此外，复凝聚回收条件温和，避免了工业上的酸热处理，保留了马铃薯糖蛋白的初始性质，为实现高附加值产品生产提供了有利的条件。
发明内容
本发明的目的是提供一种从马铃薯淀粉加工废水中回收糖蛋白的方法。选用复凝聚法，利用天然多糖回收马铃薯淀粉废水中的糖蛋白，避免了工业上的酸热条件，最大程度保留了糖蛋白的功能性质。实现废水蛋白的回收利用和壳聚糖的循环使用，并减少了废水对环境造成的污染。
本发明的技术方案：一种从马铃薯淀粉加工废水中回收糖蛋白的方法，以马铃薯淀粉加工过程中产生的含蛋白质的废水为原料，选择天然阳离子多糖壳聚糖配制成一定浓度的溶液，按一定的蛋白/多糖比例加入到废水中进行复凝聚;复凝聚所得蛋白壳聚糖复合物沉淀经过复合物分离，再经蛋白质干燥，得到马铃薯糖蛋白产品;
具体步骤如下：
(1)初步处理：取马铃薯淀粉加工废液，经过0.45μm微孔滤膜过滤;并测定废液中的蛋白含量;
(2)复凝聚：取壳聚糖，溶解于质量浓度为1%的乙酸溶液中，得到质量浓度为1%的壳聚糖溶液;
取步骤(1)中初步处理的废水，在搅拌条件下按照蛋白︰壳聚糖质量比为5︰1-1︰5添加壳聚糖溶液，用pH调节剂调节pH至5-7;搅拌10min，静置30min，25℃下以2500-4000g的速度离心10-15min，过滤;取上清液测定蛋白含量，计算蛋白回收率，所得沉淀为蛋白壳聚糖复合物;
(3)复合物分离：在步骤(2)所得的蛋白壳聚糖复合物沉淀中添加水进行复溶，其固液比为1︰5-10;充分搅拌后得到悬浮液，用pH调节剂调节pH至7.5-9.0，继续搅拌1-2h，于25℃下，以2500-4000g的速度离心10-15min，过滤;所得上清液为马铃薯糖蛋白溶液，测定蛋白含量，计算蛋白溶出率，所得沉淀为壳聚糖;
(4)蛋白质干燥：取步骤(3)所得上清液，在10~25Pa、-50~-65℃条件下真空冷冻干燥48~60h，即得回收的马铃薯糖蛋白产品。
采用Bradford法测定蛋白含量。
pH调节剂为0.1-4mol/L的盐酸或氢氧化钠溶液。
马铃薯废水中的蛋白回收率为41%-52%;马铃薯糖蛋白产品的纯度达到82%-90%，pH 7.0条件下溶解度为94%-97%，乳化活性为180-201m2/g。
Bradford蛋白含量测定法：
a、稀释：用牛血清白蛋白(BSA)，配制成1.0 mg/mL和0.1mg/mL的标准蛋白质溶液。称100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL质量浓度为95%的乙醇后，再加入100mL质量浓度为85%的磷酸，用水稀释至1L。
b、0.1-1mg/mL的标准曲线的绘制：用1.0mg/mL的标准蛋白质溶液在各试管中分别加入0，0.01，0.02，0.04，0.06，0.08，0.1mL，然后用去离子水补充到0.1mL最后各试管中分别加入5.0mL考马斯亮蓝G-250试剂，旋涡混匀。5分钟后，用比色皿在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管，即0.1mL H2O加5.0mL G-250;绘制得到的标准曲线如图2所示。
c、0-0.1mg/mL的标准曲线的绘制：用0.1mg/mL的标准蛋白质溶液给各试管分别加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1mL，然后用去离子水补充到1mL。最后各试管中分别加入5.0mL考马斯亮蓝G-250试剂，旋涡混匀。5分钟后，用比色皿在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管，即1mL H2O加5.0mL G-250，绘制得到的标准曲线如图3所示。
回收率的测定：通过Bradford法测定初始废水溶液的蛋白含量C0，向一定体积废水中按一定比例加入壳聚糖溶液，搅拌，调节溶液pH，离心后上清液蛋白含量为C1，溶液稀释系数为?，则回收率w可以计算为
w(%)=100- C1×100/(C0×?)。
氨基酸组成的测定：氨基酸分析用高效液相色谱法(HPLC)，称200mg干燥样品于水解管内，加入8mL、6mol/L的HCl溶液，酒精喷灯封管。110℃下水解22h，将水解液移入25mL容量瓶，定容。取一定量过滤，取1mL于50℃干燥器蒸酸，加入低浓度的酸在12000r/min下离心10min，衍生化后进样分析。
回收蛋白组分分析：Tricine-SDS-PAGE方法。
溶解性质测定：制备0.2%(w/v)浓度的蛋白溶液，称取定量蛋白溶于去离子水，充分搅拌，调节溶液pH值至9.0，至沉淀完全溶解。将溶解好的蛋白溶液等量取8份，分别用0.1mol/L和1mol/L的盐酸调节pH为2，3，4，5，6，7，8，9。分别于3000 g下离心15min，测定上清蛋白含量，计算出各个pH值下的蛋白溶解度，绘制溶解度随pH的变化曲线。
乳化性质测定：用分光光度法测定，包括乳化活性和乳化稳定性。先制备0.1%(w/v)、pH 7.0的蛋白溶液，0.1%(w/v)SDS溶液，乳化活性测定为取30mL蛋白溶液，加入10mL大豆油，28000 rpm下高速剪切1 min，立即从底部取50μL于试管中，并开始计时，取5mL SDS溶液于试管，漩涡混匀后立即测定500nm下的吸光值，以SDS溶液为空白。乳化活性计算公式为EAI(m2/g)=2×2.303×A0×D/?×C×10000。均质后0min测定的吸光值记为A0，D为稀释因子(100)，?为油部分体积含量(0.25)，C为蛋白液初始浓度。
乳化稳定性测定选取记时开始后10min，从底部吸取50μL于试管中，取5mL SDS溶液于试管，漩涡混匀后立即测定500nm下的吸光值A1，乳化稳定性计算公式为ESI(min)= A0×10/(A0- A1)。
本发明的有益效果：
(1)有效的回收了马铃薯淀粉废水中的糖蛋白，减少了资源的浪费。
(2)有效的保留了回收蛋白质的功能性质，获得高品质蛋白产品。
(3)所用试剂和方法相对简单，经济，实用性强。
(4)壳聚糖可经回收重复利用，具有良好的经济效益。