申请日2014.09.23
公开(公告)日2015.01.21
IPC分类号C12N1/21; C02F101/38; C12R1/125; C02F3/34
摘要
一株腈降解生物膜形成基因工程菌及在含腈废水处理中的应用属于生物工程技术;该基因工程菌株Bacillus subtilis N4-pHT01-Nitr，已于2014年07月25日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCCNo.9484。该菌株是通过基因工程于段将Rhodococcus rhodochrous BX2中的腈水解酶基因插入到Bacillus subtilis N4中表达而得。该菌株能够产生生物膜并且降解乙腈，经过在合成废水中37℃，60r/min培养48h，生物膜形成量OD570nm值为1.45;在含有800mg/L乙腈的合成废水中，37℃，160rpm振荡培养48h后乙腈的残留浓度为23.56mg/L。该菌株抗乙腈冲击能力强，在移动床生物膜反应器运行35d后，可将合成废水中800mg/L的乙腈降至出水的0.32mg/L，合成废水的COD值由487mg/L降至出水的16.39mg/L。本发明的菌株为利用生物膜法处理含腈废水提供了新方法。
权利要求书
1.一株腈降解生物膜形成双功能基因工程菌枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis N4-pHT01-Nitr，该菌株已 于2014年07月25日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)”，保藏 号为CGMCCNo.9484。
2.如权利要求1所述的一株腈降解生物膜形成双功能基因工程菌枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis N4-pHT01-Nitr产生生物膜。
3.如权利要求1所述的一株腈降解生物膜形成双功能基因工程菌枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis N4-pHT01-Nitr用于降解乙腈。
4.如权利要求3所述的一株腈降解生物膜形成双功能基因工程菌枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis N4-pHT01-Nitr在含腈废水处理中的应用。
说明书
一株腈降解生物膜形成基因工程菌及在含腈废水处理中的应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，主要涉及一株腈降解-生物膜形成双功能基因工程菌及其在含腈废水处 理中的应用。
背景技术
乙腈是一种含氰基(R-CN)的有机化工原料，广泛用于制药、合成纤维、石油化工等领域，是含腈废水 中的主要成分之一。含腈废水中的乙腈进入自然水域后会引起鱼类等水生生物大批死亡，对生态环境造成 严重的破坏。乙腈可由吸入、食入及皮肤吸收而进入体内，在生物体内转化为剧毒物质——氰化氢和乙醛， 威胁人畜健康。腈水解酶(nitrilase)是腈降解菌代谢腈类化合物的重要降解酶之一，通过一步反应即可将 腈转化为相应的羧酸和氨。
生物膜(Biofilms)是指由附着于惰性或者活性实体表面的细菌细胞和包裹细菌的水合性基质所组成的 结构性细菌群落。形成生物膜是绝大多数微生物生长的最理想模式，生物膜能够有效地阻止抗菌剂、杀虫 剂、重金属、宿主防御机制等的伤害，提高细菌在环境中的适应性。研究发现，细菌在生物膜中比浮游状 态下的代谢活力更强，降解质粒发生转移的频率更高，有利于废水的生物处理。然而在自然状态下，生 物膜内微生物菌群往往不能承受高浓度有毒物质，所以当在处理高浓度难降解废水时效率较低，甚至失效。 因此，有针对性的筛选降解某种污染物的微生物，将其与生物膜形成菌一起加入生物反应器中强化污水治 理是解决上述问题的一种行之有效的方法。但此方法也存在一定问题，主要包括：①污染物降解菌与成膜 菌之间有可能存在竞争生长;②污染物降解菌若无法很好地定殖于成膜菌中，则降解菌容易流失，废水处 理效果不佳。如果将对污染物具有降解能力的基因转入生物膜形成菌中，就可以在一定程度上解决上述问 题，从而降低处理成本、减少污染。因此利用基因工程手段构建多功能工程菌株，开发出既具有降解腈类 化合物能力，同时又具备生物膜形成能力的双功能菌株，用于含腈废水的生物膜法处理中，将具有较高的 经济效益、社会效益和生态效益。
发明内容
本发明的目的在于构建一株高效表达腈水解酶同时可形成生物膜的基因工程菌枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis N4-pHT01-Nitr，并将该菌株应用于降解乙腈及含腈废水的处理。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
本发明所提供的腈降解生物膜形成双功能基因工程菌株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis N4-pHT01-Nitr， 已于2014年07月25日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)”，其 保藏号为CGMCCNo.9484。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编 码：100101。
本发明利用的原始菌株为乙腈高效降解菌Rhodococcus rhodochrous BX2和具有强生物膜形成能力的 Bacillus subtilis N4。本发明利用基因工程手段将Rhodococcus rhodochrous BX2中的腈水解酶基因(腈水解 酶可降解乙腈)插入到Bacillus subtilis N4中表达，获得腈降解-生物膜形成双功能菌株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis N4-pHT01-Nitr。
所述的基因工程菌株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis N4-pHT01-Nitr是通过如下方法构建的：以 Rhodococcus rhodochrous BX2的总DNA作为模板，根据腈水解酶基因的基因序列和枯草芽孢杆菌表达载 体pHT01的多克隆酶切位点设计引物，通过PCR扩增出腈水解酶基因DNA片段。将腈水解酶基因片段克 隆到pMD18-T载体上，经PCR鉴定出的阳性克隆进行测序，将测序成功的PCR产物腈水解酶基因片段通 过酶切位点连接到原核表达载体pHT01上，转入大肠杆菌DH5α中，经质粒PCR和XbaI/AatII双酶切鉴 定，筛选阳性重组子，成功构建枯草芽孢杆菌原核表达载体pHT01-Nitr，通过电转化法将表达载体 pHT01-Nitr转入具有生物膜形成能力的野生型Bacillus subtilis N4中。经过提取质粒PCR、双酶切和测序 筛选出阳性重组克隆，构建含腈水解酶基因的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis N4-pHT01-Nitr双功能菌。
所述的基因工程菌株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis N4-pHT01-Nitr能够产生生物膜：枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis N4-pHT01-Nitr在合成废水中37℃，60r/min培养48h内，生物膜形成量OD570nm值可达 到1.4以上。
所述的基因工程菌株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis N4-pHT01-Nitr可以降解乙腈：在含有800mg/L乙 腈的合成废水中，接种双功能菌枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis N4-pHT01-Nitr后，乙腈浓度迅速下降，48h 后乙腈的残留浓度为23.56mg/L。
所述的基因工程菌株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis N4-pHT01-Nitr在含腈废水处理中的应用：合成废 水中乙腈的添加浓度为800mg/L，在抗冲击能力实验中，枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis N4-pHT01-Nitr的 抗乙腈冲击能力强，在连续六次更换合成废水后，其最终在诱导8小时内对合成废水中乙腈的降解率达到 49%;在生物反应器处理含腈废水试验中，投加活性污泥与枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis N4-pHT01-Nitr 的MBBR反应器在运行35d乙腈浓度为0.32mg/L，出水COD值为16.39mg/L。
所述的原始菌株Rhodococcus rhodochrous BX2和Bacillus subtilis N4均由本实验室分离所得。(孙晶， 熊明华，成小松，李悦，臧海莲，李春艳。Rhodococcus sp.BX2菌对乙腈的降解特性及其降解途径研究[J]. 环境科学学报，2012，32(5)：1041-1048.Chunyan Li，Yue Li，Xiaosong Cheng，Liping Feng，Chuanwu Xi，Ying Zhang.Immobilization of Rhodococcus rhodochrous BX2(an acetonitriledegrading bacterium)with biofilm-forming bacteria for wastewater treatment，Bioresource Technology 131(2013)390-396.)
E.coli competent cells DH5a购自TransGen。
质粒载体pMD18-T simple vector，购自大连宝生物科技有限公司。
枯草杆菌表达载体pHT01购自德国分子生物技术(Molecular Biotechnology)公司。
本发明提供的菌株，一方面充实了乙腈降解的微生物资源，另一方面，通过基因克隆手段使成膜菌不 仅具有成膜能力，同时还具有腈降解功能，进一步研究其用于移动床生物膜反应器(MBBR)处理含腈废 水的效果，为含腈废水处理新方法的开发奠定了基础。