申请日2010.02.10
公开(公告)日2012.05.23
IPC分类号C12P19/26; C12P19/00; C12N9/10; C02F103/32; C12R1/01; C12R1/685; C02F1/56
摘要
本发明提供了一种大豆乳清生物絮凝剂的制备方法。将A菌肠膜明串珠菌发酵产生的糖苷液与B菌乳酸乳球菌乳脂亚种发酵产生的乙酰氨基葡萄糖液等体积混合，然后按混合液的5%加入C菌黑曲霉发酵产生的糖苷转移酶粗酶液，50℃、100转/分钟摇床反应6小时，使A菌糖苷液在C菌糖苷转移酶的作用下与B菌胞外多糖反应，生成高分子糖苷——乙酰氨基葡萄糖苷，按反应液体积的20%添加浓度为48%——60%的乙醇，静止1小时，5000转/分钟离心20分钟，取沉淀即为絮凝剂，经真空干燥，每升反应液可得絮凝剂20-23克。
权利要求书
1.一种用于大豆乳清废水处理的絮凝剂的制备方法，其特征在于：
将A菌发酵产生的糖苷液与B菌乳酸乳球菌乳脂亚种发酵产生的乙酰氨基葡萄糖液等体 积混合，然后按混合液体积的5%加入C菌黑曲霉发酵产生的苷转移酶粗酶液，制备乙酰氨基 葡萄糖苷;其中：A菌为肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)，保藏号为CICC 20074; B菌为乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.cremoris)，保藏号为CICC 20408; C菌为黑曲霉(Aspergillus niger)，保藏号为CICC 40023;具体步骤如下：
(1)A菌制备糖苷液：按培养基体积的5%接种已经活化的菌种，在28℃厌氧箱内静止 培养48小时，5000转/分钟离心20分钟，取上清液即为A菌糖苷液;
(2)B菌制备乙酰氨基葡萄糖液：按培养基体积的5%接种已经活化的菌种，在35℃厌 氧箱内静止培养60小时，5000转/分钟离心20分钟，取上清液即为B菌产生的乙酰氨基葡 萄糖液;
(3)C菌制备苷转移酶粗酶液：按培养基体积的5%接种已经活化的菌种，25℃、120转 /分钟摇床培养24小时，5000转/分钟离心20分钟，取上清液即为C菌糖苷转移酶粗酶液;
(4)乙酰氨基葡萄糖苷的生成：
取等体积的A菌糖苷液和B菌产生的乙酰氨基葡萄糖液混合均匀，加入混合液体积5%的 C菌糖苷转移酶粗酶液，50℃、100转/分钟摇床反应6小时，使A菌糖苷液在C菌糖苷转移 酶的作用下与B菌胞外多糖反应，生成高分子糖苷——乙酰氨基葡萄糖苷;
(5)絮凝剂的获得：按反应液体积的20%添加浓度为48%-60%的乙醇，静止1小时，5000 转/分钟离心20分钟，取沉淀即为絮凝剂，经真空干燥，每升反应液可得絮凝剂20克-23 克。
2.根据权利要求1所述的一种用于大豆乳清废水处理的絮凝剂的制备方法，其特征在于： A菌制备糖苷液所用的培养基组成为：西红柿汁10g，吐温80 0.05g，酵母膏0.75g，蛋白 胨0.75g，葡萄糖1g，磷酸氢二钾0.2g，碳酸钙1g，水90g，pH7.0;B菌制备糖苷液所用的 培养基组成为：酵母浸膏7.5克，蛋白胨7.5克，葡萄糖10克，磷酸二氢钾2克，番茄汁 100毫升，吐温80 0.5毫升，水900毫升，pH7.0;C菌制备糖苷酶所用的培养基为6～7°Bé 米曲汁。
说明书
一种用于大豆乳清废水处理的絮凝剂的制备方法
(一)技术领域
本发明涉及大豆乳清废水处理中使用的絮凝剂，具体涉及一种利用微生物制备的、用于 大豆乳清废水处理的絮凝剂。
(二)背景技术
我国是大豆的故乡，大豆食品的生产具有悠久的历史。近年来，国家投入大量的人力、 物力发展新型大豆食品工业，生产各种各样的大豆制品，改善人们的膳食结构，极大地提高 了人民的生活水平，加速了社会经济的发展。但在大豆制品生产过程中，往往会产生大量的 大豆乳清废水，该废水中有机物含量较高，BOD5达6000-8000mg/L，COD达18000-20000mg/L， 有机物主要以蛋白质和低聚糖为主。一些厂家对这些废水的肆意排放，对环境造成很大的污 染。而对于大多数大豆深加工企业来说，充分利用这些大豆乳清废水并非易事，目前采用膜 分离技术将乳清废水中的低聚糖和蛋白质分离，取得了一定的效果，但设备投资和维护费用 很大，分离成本很高，可操作性不强，故膜分离技术在大豆乳清废水处理方面仅限于研究状 态。
大多数大豆深加工企业采用有机合成高分子絮凝剂来处理乳清废水，使废水中的有机物 快速絮凝后，进行简单分离达到排放指标后排放，但多数合成的有机高分子絮凝剂含有铝盐 和铁盐，长期使用有“三致”作用，即致癌、致畸、致突变，对人类健康依然造成严重的威 胁。针对目前状况，科研人员对微生物絮凝剂加快了研发步伐，很多微生物絮凝剂随之诞生， 并且应用于废水处理当中，但微生物代谢繁殖受环境制约，使用起来麻烦，虽然效果比较好， 但生产成本较高，大多企业难以接受，故产品推广受到严重制约。
本发明将微生物代谢的胞外多糖和糖苷在糖苷转移酶的作用下生物合成一种高分子糖苷 ——乙酰氨基葡萄糖苷，该糖苷易于在乙醇溶液中絮凝，从而易于分离，沉降有机物效率高， 可自然降解，无毒无害，对环境不产生二次污染，大豆乳清中沉降下来的有机质是大豆蛋白 和大豆低聚糖的结合体，可以重返食品加工业，形成食品加工环境保护产业链的良性循环。
(三)发明内容
一种用于大豆乳清废水处理的絮凝剂的制备方法本发明的目的是这样实现的：本发明中 所涉及的百分比除另有注明之外为体积比，本发明的产品采用这样的方法来制备的：
1.使用菌株来源
使用菌株购买于中国工业微生物菌种保藏中心，名称及编号分别为：
A菌——肠膜明串珠菌CICC 20074、B菌——乳酸乳球菌乳脂亚种CICC 20408、C菌— —黑曲霉CICC 40023。
2.培养基配置
A菌：西红柿汁10g，吐温80 0.05g，酵母膏0.75g，蛋白胨0.75g，葡萄糖1g，磷酸 氢二钾0.2g，碳酸钙1g，水90g，pH7.0，西红柿汁制备：西红柿榨汁制得。
B菌：酵母浸膏7.5克，蛋白胨7.5克，葡萄糖10克，磷酸二氢钾2克，番茄汁100毫 升，吐温80 0.5毫升，水900毫升，pH7.0。
C菌：6～7°Bé米曲汁。
3.絮凝剂制备过程
3.1 A菌糖苷的制备
量取0.9%的生理盐水10ml于试管内，经121℃灭菌20分钟冷却至28℃，将A菌安瓶内 的冻干菌粉末在无菌状态下全部倒入0.9%的生理盐水中，震荡使其溶解，在20℃恒温箱中静 止活化30分钟，备用;量取A菌培养基200ml于500ml三角瓶内，121℃灭菌20分钟冷却至 28℃，按培养基体积的5%接种已经活化的菌种，在28℃厌氧箱内静止培养48小时，5000转 /分钟离心20分钟，取上清液即为A菌糖苷液。
3.2 B菌胞外多糖的制备
量取0.9%的生理盐水10ml于试管内，经121℃灭菌20分钟冷却至35℃，将B菌安瓶内 的冻干菌粉末在无菌状态下全部倒入0.9%的生理盐水中，震荡使其溶解，在20℃恒温箱中静 止活化30分钟，备用;量取B菌培养基200ml于500ml三角瓶内，121℃灭菌20分钟冷却至 35℃，按培养基体积的5%接种已经活化的菌种，在35℃厌氧箱内静止培养60小时，5000转 /分钟离心20分钟，取上清液即为B菌胞外多糖液，该多糖化学名称为乙酰氨基葡萄糖。
3.3糖苷转移酶的制备
量取0.9%的生理盐水10ml于试管内，经121℃灭菌20分钟冷却至28℃，将C菌安瓶内 的冻干菌粉末在无菌状态下全部倒入0.9%的生理盐水中，震荡使其溶解，在20℃恒温箱中静 止活化30分钟，备用;量取C菌培养基200ml于500ml三角瓶内，121℃灭菌20分钟冷却至 25℃，按培养基体积的5%接种已经活化的菌种，25℃、120转/分钟摇床培养24小时，5000 转/分钟离心20分钟，取上清液即为C菌糖苷转移酶粗酶液。
3.4乙酰氨基葡萄糖苷的生成
取等体积的A菌糖苷液和B菌胞外多糖液混合均匀，加入混合液体积5%的C菌糖苷转移 酶粗酶液，50℃、100转/分钟摇床反应6小时，使A菌糖苷液在C菌糖苷转移酶的作用下与 B菌胞外多糖反应，生成高分子糖苷——乙酰氨基葡萄糖苷。
3.5絮凝剂的制备
按反应液体积的20%添加浓度为48%-60%的乙醇，静止1小时，5000转/分钟离心20分 钟，取沉淀即为絮凝剂，经真空干燥，每升反应液可得絮凝剂20克-23克。
4.应用效果
每升大豆乳清废水中加入10mg絮凝剂粗品，静止处理20分钟后，BOD5和COD去除率如 下表所示：