申请日2014.09.30
公开(公告)日2014.12.17
IPC分类号G01N21/64
摘要
本发明公开了属于一种检测活性污泥中革兰氏阴性菌相对含量的方法，属于生物分析技术领域。该方法包括如下步骤：对污泥进行高压均质破碎;破碎后污泥在酸性环境下解离;水解后加入MDB荧光试剂与解离出的LPS发生衍生反应;衍生产物通过高效液相色谱分离并使用荧光进行定量分析;根据所得分析结果获得活性污泥中革兰氏阴性菌相对含量的信息。本发明操作简单、快速，避免使用复杂、昂贵且重复性差的分子生物学相关技术，同时所得结果准确、可靠。
权利要求书
1.一种检测活性污泥中革兰氏阴性菌相对含量的方法，其步骤为：
步骤一，破碎活性污泥中菌胶团;
步骤二，从游离细菌及细胞碎片中分离KDO;
步骤三，对分离出的KDO进行荧光标记得到荧光衍生产物;
步骤四，衍生后产物通过高效液相色谱进行分离并用荧光进行定量检测，根 据所得结果获得活性污泥中革兰氏阴性菌相对含量的信息。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤一中将污泥中菌胶团或游离的 细菌破碎为细胞碎片。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤一中加入强酸至破碎后的污泥 并水浴加热。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于步骤三中对分离出的KDO 使用MDB溶液进行荧光标记，得到荧光衍生产物。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于根据高效液相色谱定量 结果与样品对应MLSS值得到活性污泥中革兰氏阴性菌相对含量的信息：将测 定出的不同污泥样品中KDO含量除以各个污泥样品的污泥质量浓度(MLSS)， 即革兰氏阴性菌相对含量
说明书
一种检测活性污泥中革兰氏阴性菌相对含量的方法
技术领域
本发明涉及一种评价污泥工作性能的方法，具体而言是检测活性污泥中革兰 氏阴性菌相对含量。
背景技术
活性污泥法在处理城市和工业废水中有着广泛的应用。污水生物处理效率及 其控制是由微生物的数量和质量决定的。微生物量与污水特征和去除效率紧密相 关。活性污泥中的生物量由混合液悬浮固体浓度(MLSS)、混合液挥发性悬浮固 体浓度(MLVSS)表示。但是MLSS和MLVSS不仅仅包含活性微生物，还包括所有 的颗粒物质和细胞碎片。因此上述两个评价指标并不能很好地代表有活性的微生 物量。
现代分子生物学技术PCR技术和变性梯度凝胶电泳(DGGE)可以对活性污泥 进行分析，得到活性污泥中各微生物的含量。PCR法在该领域应用非常广泛，但 是它们也存在许多的不足之处：①每次DNA的提取效率不同，从而导致结果重 复性差;②原核生物细胞裂解的程度不同，结果不易裂解细胞的丰度估计偏低; ③引物对不同样品的扩增效率又差异，故会带来群落丰度估计偏差。
细菌是活性污泥的组成和净化功能中心，是活性污泥有机相的最主要成分。 1993年Wagner等利用荧光探针特异性地与活性污泥菌胶团杂交，然后利用EM 观察技术，结果发现样品B1和B2中α-、β-和γ-变形菌类群含量分别为：10%、 42%和34%，37%、37%、和7%;这三个类群的总含量均超过了活性污泥总细胞的 80%，因此，他们认为活性污泥中的优势菌群是α-、β-和γ-变形菌。后来Wagner 等又利用LSCM扫描直观清晰地描述了这个结果。
由于活性污泥中优势菌为α-、β-和γ-变形菌，而变形菌门全部属于革兰 氏阴性菌，因此检测活性污泥样品中革兰氏阴性菌的相对含量，对于评价污泥活 性、了解部分微生物群落结构，有着极其重要的意义。
脂多糖又名内毒素，是一种嵌入在革兰氏阴性细菌外膜中复杂的糖脂，是革 兰氏阴性菌所特有。因此，通过检测革兰氏阴性菌特有的脂多糖(或内毒素)， 理论上可以推导出革兰氏阴性菌的相对量。每个细胞含有超过200万个LPS分子。 LPS的分子结构可以分为3个区域：O-特异性多糖链(也称O-抗原)、核心多糖 和类脂A(Lipid A)。核心多糖区分为外核区与内核区，离类脂A远的外核区是 经常出现的糖，如葡萄糖、乳糖和乙酰葡糖胺。目前中国药典规定的内毒素检测 方法是鲎试剂法。美洲鲎(LAL)和东方鲎(TAL)两种用于生产鲎试剂。但是 LAL/TAL试验属于生物毒性测试方法，不是精确的分析方法，一些非内毒素分子 如Beta-葡聚糖也能引起相似的凝集现象。LAL/TAL试剂为鲎血的提取物，属于 生物试剂，样品中化学物质蛋白和其他试剂容易对其产生影响。与药典规定的药 品和医疗器械相比活性污泥样品成分复杂，干扰因素明显。因此LAL/TAL不适合 污泥样品中内毒素的检测。
发明内容
1、发明要解决的技术问题
现有技术不能检测活性污泥中革兰氏阴性菌相对含量，为了快速检测活性污 泥中优势菌的相对含量，更准确了解污泥活性以及群落的相对结构。本发明的目 的在于提供一种检测活性污泥中革兰氏阴性菌相对含量的分析方法，能准确、定 量分析。
2、技术方案
发明原理：核心多糖区分为外核区与内核区，临近类脂A的内核区由庚糖、 2-酮基，3-脱氧辛酸(KDO)组成。内核区中的2-酮基3-脱氧辛酸为活性污泥中 LPS分子所特有，且每个LPS分子包含2个KDO分子。因此，通过检测特异性的 KDO分子的含量，从理论上可以推导出阴性菌的相对量。检测KDO技术属于理化 检测，较生物测试方法更准确。
本发明所采用的技术方案具体步骤如下：
一种检测活性污泥中革兰氏阴性菌相对含量的方法，其步骤为：
步骤一，高压均质破碎活性污泥中菌胶团;
步骤二，酸性条件下从游离细菌及细胞碎片中分离KDO(2-酮基-3-脱氧辛 酸);
步骤三，对分离出的KDO进行荧光标记，得到荧光衍生产物，避光保存;
步骤四，衍生后产物通过高效液相色谱进行分离并用荧光进行定量检测，根 据所得结果获得活性污泥中革兰氏阴性菌相对含量的信息。
所述破碎污泥中的菌胶团，是通过高压均质破碎，将污泥中团聚的细菌打碎， 打碎成游离的细菌或将整个细胞破碎为细胞碎片。从而减轻后续解离KDO步骤的 压力，缩短反应时间。
所述从游离细菌或细胞碎片中分离KDO，是加入强酸至破碎后的污泥，并加 热。从而将固着在细胞膜上的LPS解离出来，形成游离型LPS，并进一步将LPS 中的KDO分子全部解离出来，使得后续的化学衍生反应完全，荧光定量准确。
所述对分离出来的KDO进行荧光标记，是加入适量的荧光标记物以及相应的 稳定剂到经过酸化后的活性污泥液体中，使解离出的游离KDO与加入的荧光标记 物进行反应，生成相应的衍生产物。
所述根据所得结果得到活性污泥中革兰氏阴性菌相对含量的信息，是指将测 定出的不同污泥样品中KDO含量除以各个污泥样品的污泥质量浓度(MLSS)，即
3、有益效果
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(一)本发明可以分析各种不同工艺段的活性污泥样本的革兰氏阴性菌相对含 量。本发明所使用的方法操作简便，成本低廉，适用于一般的实验室操作。
(二)本发明不需要纯培养就可以根据活性污泥中的KDO的含量计算出革兰氏 阴性菌相对量，避免传统的培养染色法鉴定计量革兰氏阴性菌由于细菌对 培养基的选择性而引起的误差。
(三)本发明避免使用基于PCR扩增的分子生物学相关技术来分析革兰氏阴性 菌相对量，从而规避了PCR过程中由于引物特异性和非特异性，扩增效率 以及PCR本身固有的偏向性所产生的误差。