申请日2015.03.18
公开(公告)日2015.06.10
IPC分类号C12Q1/68; C02F1/32; C02F9/08; C12N15/10
摘要
本发明公开了基于消毒技术去除污水中抗生素抗性基因的方法，采用紫外和氯化联合工艺，达到去除污水中抗生素抗性基因的方法，具体的步骤如下：采集含有抗生素抗性基因的污水至灭菌容器中，将水样分别进行紫外光照15s、30s;光照后立即加入NaClO使游离氯分别达到5、20、40mg/L，搅拌，反应120min后加入Na2S2O3以终止反应;取水样用膜过滤;将富集微生物的膜剪碎，提取DNA;定量PCR，检测抗生素抗性基因ARGs的含量。本方法采用UV及氯化联合技术可以产生协同作用，在常规的UV、氯化消毒剂量下较为有效的增加对目标基因的去除率，氯化剂量越小时，协同作用越大。
摘要附图
权利要求书
1.基于消毒技术去除污水中抗生素抗性基因的方法，其特征在于，采用紫 外和氯化联合工艺，达到去除污水中抗生素抗性基因的方法，具体的步骤如下：
(1)水样预处理
采集含有抗生素抗性基因的污水至灭菌容器中;
(2)消毒
在室温下，将上述步骤(1)采集的水样分别进行紫外光照15s、30s，相 应的UV剂量分别为62mJ/cm2、125mJ/cm2;光照后立即加入NaClO使游离氯 分别达到5mg/L、20mg/L、40mg/L，使用搅拌器搅拌，反应120min后加入 1.5%的Na2S2O3以终止反应;
(3)膜过滤
取200mL上述步骤(2)处理的水样，用0.22μm混合纤维滤膜过滤;过 滤后保留滤膜并置于50%乙醇中于-20℃保存以待后续的DNA提取以及随之的 基因定量;
(4)DNA提取
将富集微生物的膜剪碎，提取DNA;
(5)定量PCR
使用实时定量聚合酶链式反应PCR法对四环素类抗性基因tetX、tetG、磺 胺类抗性基因sul、1型整合子编码基因intIl及16S rDNA作出定量，所述的定 量步骤包括：a)配制PCR反应体系溶液;b)使用PCR扩增仪进行扩增;c)PCR 后产物进行琼脂糖凝胶电泳;d)测定PCR产物浓度;
(6)检测抗生素抗性基因ARGs的含量并分析结果。
2.根据权利要求1所述的基于消毒技术去除污水中抗生素抗性基因的方法， 其特征在于，所述的紫外消毒采用有机玻璃制成的圆柱形光化学反应器，圆柱 形光化学反应器中间竖直放置石英套管，石英套管内放置紫外灯，石英套管外 壁254nm处的紫外光强为9.85mW/cm2，紫外线有效剂量为4.159mW/cm2。
3.根据权利要求1所述的基于消毒技术去除污水中抗生素抗性基因的方法， 其特征在于，所述的DNA提取具体步骤如下：
a)将滤膜在室温下解冻并剪碎加入裂解管E管中;
b)向上述管中加入978μL磷酸钠缓冲液，及122μL MT Buffer;
c)将E管放在FastPrep中以速度为6.0m/s振荡40s。随后将E管放置在离 心机中以14,000×g离心10min;
d)离心后，将上清液转移新的2mL离心管中，加入250μL蛋白沉淀溶液， 手摇10次离心管混合溶液;
e)将离心管放入离心机以14000×g离心5min，将上清液转移至15mL离 心管，并加入1mL DNA结合溶液，促进DNA与硅胶结合，将离心管上下颠倒 2min，随后将离心管放至在架子上静置3min;
f)小心去除500μL的上清液，重新悬浮剩余的混合液;转移约600μL的混 合液到含SPINTM Filter的管中，以14000×g离心1min;接着将SPINTM Filter 管中的液体倒掉;重复上述过程直到剩余混合液全部转移离心完;
g)加入500μL SEWS-M，溶解和清洗DNA至SPINTM Filter管中，用移液 枪吹打使沉淀物重新悬浮后以14000×g离心1min;将SPINTM Filter管中的液 体倒掉，再以14000×g离心2min，去除基质中的SEWS-M;
h)将SPINTM Filter放到新的Catch Tube中，于室温下风干5min后加入80μL DES，用移液枪枪头在滤膜上轻轻搅动，使滤膜上的沉淀物重新悬浮后以14000 ×g离心1min，DNA则转移至Catch Tube中;
i)将提取的DNA于-20℃或在4℃保存，用于接下来的PCR扩增及其他 步骤。
4.根据权利要求1所述的基于消毒技术去除污水中抗生素抗性基因的方法， 其特征在于，所述的PCR反应体系溶液为25μL，包括：2.5μL 10×PCR缓冲 液，2μL MgCl2，2μL dNTP混合剂，上下引物各0.2μL，0.125μL Ex Taq DNA 聚合酶，2μL DNA模板，即提取的DNA稀释至约20ng/μL，及ddH2O使体系 至25μL。
5.根据权利要求1所述的基于消毒技术去除污水中抗生素抗性基因的方法， 其特征在于，使用PCR扩增仪进行扩增，反应温度程序为94℃变性5min后进 入35个循环，每个循环中，先在94℃反应45s，随之在退火温度下反应45s， 之后在72℃下反应90s，循环反应之后再于72℃下反应10min，实验中ARGs 的扩增效率在90%～100%之间，标曲相关系数R2均大于0.99。
6.根据权利要求1所述的基于消毒技术去除污水中抗生素抗性基因的方法， 其特征在于，PCR后产物进行琼脂糖凝胶电泳，以观测是否有目标ARGs的扩 增产物，对于含有目标ARGs的PCR产物进行纯化，后进行质粒制备。
7.根据权利要求6所述的基于消毒技术去除污水中抗生素抗性基因的方法， 其特征在于，琼脂糖凝胶电泳的具体步骤为：
称取0.3g琼脂糖于锥形瓶中，加入1×TAE 30mL，加热炉加热琼脂糖，加 热均匀后待溶液冷却至30℃左右时向溶液中加入2μL溴化乙锭，随后将溶液 倒入胶床内，插入梳子，放置60min左右待凝胶固化。将凝胶放入电泳槽中， 加入l×TAE溶液，使溶液没过凝胶1-2mm。将1μL Loading Buffer与5μL的 PCR产物混合均匀，加入凝胶中上样孔中。盖上泳槽，接通电源，在100V电 泳25min，电泳结束后，取出凝胶在凝胶成像仪上观测结果。
8.根据权利要求6所述的基于消毒技术去除污水中抗生素抗性基因的方法， 其特征在于，PCR产物纯化具体步骤为：
a)在PCR产物溶液中，加入3倍产物体积Buffer PCR-A，混匀后转移至PCR 制备管，将PCR制备管置于提供好的2mL离心管中，以12000×g离心1min， 并弃掉滤液;
b)将PCR制备管置回2mL离心管，加700μL Buffer W2，以12000×g离 心1min，弃滤液。随后加入400μL Buffer W2，以12000×g离心1min;
c)将制备管置于1.5mL洁净离心管，在制备管膜中央加25-30μL Eluent或 去离子水，室温静置1min，随后以12000×g离心1min洗脱DNA。
9.根据权利要求1所述的基于消毒技术去除污水中抗生素抗性基因的方法， 其特征在于，使用超微量紫外分光光度计测定PCR产物浓度，计算其摩尔数：
使用pMD 18-T Vector构建ARGs质粒，具体操作如下：
a)在微量离心管中配置5μL体系，包括：1μL pMD 18-T Vector，0.1pmol～0.3 pmol Insert DNA，以及适量的ddH2O使体系至5μL。加入5μL的Solution I， 16℃反应30min;
b)全量即10μL加入至100μL JM109感受态细胞中，冰中放置30min。随 后42℃加热45s后冰中放置1min;
c)加入890μLSOC培养基，37℃振荡培养60min。将100μL培养液转移 至含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养形成单菌落，计数白色、 蓝色菌落;
d)挑选白色菌落使用PCR法确认载体中插入片段长度，使用质粒提取试剂 盒提取菌落质粒。
10.根据权利要求1所述的基于消毒技术去除污水中抗生素抗性基因的方 法，其特征在于，ARGs实时定量PCR检测的步骤为：
提取的质粒经10倍稀释后作为qPCR反应的标准品，使用实时定量PCR仪对 检测目标ARGs，每个qPCR反应都含有包括4～5个标准点的标准曲线，20μL 的qPCR的反应体系包括：10μL 2×powerGreen PCR混合染料，上 下引物各0.16μL，2μL模板DNA，提取的DNA稀释至约2ng/μL，7.68μL ddH2O。反应时间温度设置包括95℃反应10min后进入40个循环，每个循 环中，95℃反应15s后在退火温度下反应1min，反应后，仪器根据标准曲 线给出ARGs拷贝数，继而反推至原水中ARGs含量。
说明书
基于消毒技术去除污水中抗生素抗性基因的方法
技术领域
本发明涉及环境保护的水处理领域，特别是涉及一种消毒技术对污水中抗生 素抗性基因的净化方法。
背景技术
抗生素抗性基因(Antibtiotics Resistance Genes，ARGs)是一种新型污染物， 城市污水处理厂作为ARGs的重要储存场所，其出水也是ARGs排入水环境中 的重要污染源，控制污水处理厂出水中ARGs对减少环境中ARGs污染，降低 ARGs的生态风险具有重要意义。
消毒技术是处理城市污水中病原微生物，保证污水安全排放及回用的重要 工艺段，常用的消毒工艺有氯消毒、UV、臭氧消毒。现有关于污水厂中氯化、 UV消毒对ARGs的去除影响的报道多集中于对污水处理厂水样进行直接的监 测，相关的氯化、UV剂量等操作参数并不明确。
发明内容
本发明为了解决去除污水中的抗生素抗性基因的问题，提供了一种基于消 毒技术去除污水中抗生素抗性基因的方法，具体考察了UV、氯化联合消毒工艺 对污水中ARGs去除的影响。
解决上述技术问题的技术方案如下：
基于消毒技术去除污水中抗生素抗性基因的方法，其特征在于，采用紫外 和氯化联合工艺，达到去除污水中抗生素抗性基因的方法，具体的步骤如下：
(1)水样预处理
采集含有抗生素抗性基因的污水至灭菌容器中;
(2)消毒
在室温下，将上述步骤(1)采集的水样分别进行紫外光照15s、30s，则 UV剂量分别为62mJ/cm2、125mJ/cm2;光照后立即加入NaClO使游离氯分别达 到5、20、40mg/L，使用搅拌器搅拌，反应120min后加入1.5%的Na2S2O3以 终止反应;
(3)膜过滤
取200mL上述步骤(2)的水样，用0.22μm混合纤维滤膜过滤;过滤后保 留滤膜并置于50%乙醇中于-20℃保存以待后续的DNA提取以及随之的基因定 量;
(4)DNA提取
将富集微生物的膜剪碎，提取DNA;
(5)定量PCR
使用实时定量聚合酶链式反应PCR法对四环素类抗性基因tetX、tetG、磺 胺类抗性基因sul、1型整合子编码基因intI1及16S rDNA作出定量，所述的定 量步骤包括：a)配制PCR反应体系溶液;b)使用PCR扩增仪进行扩增;c)PCR 后产物进行琼脂糖凝胶电泳;d)测定PCR产物浓度;
(6)检测抗生素抗性基因ARGs的含量并分析结果。
优选地，所述的紫外消毒采用有机玻璃制成的圆柱形光化学反应器，圆柱 形光化学反应器中间竖直放置石英套管，石英套管内放置紫外灯，石英套管外 壁254nm处的紫外光强为9.85mW/cm2，紫外线有效剂量为4.159mW/cm2。
优选地，所述的NaClO的有效氯≥8%。
优选地，所述的DNA提取具体步骤如下：
a)将滤膜在室温下解冻并剪碎加入裂解管E管中;
b)向上述管中加入978μL磷酸钠缓冲液，及122μL MT Buffer;
c)将E管放在FastPrep中以速度为6.0m/s振荡40s。随后将E管放置在离 心机中以14000×g离心10min;
d)离心后，将上清液转移新的2mL离心管中，加入250μL蛋白沉淀溶液， 手摇10次离心管混合溶液;
e)将离心管放入离心机以14000×g离心5min，将上清液转移至15mL离 心管，并加入1mL DNA结合溶液，促进DNA与硅胶结合，将离心管上下颠倒 2min，随后将离心管放至在架子上静置3min;
f)小心去除500μL的上清液，重新悬浮剩余的混合液;转移约600μL的混 合液到含SPINTMFilter的管中，以14000×g离心1min;接着将SPINTMFilter 管中的液体倒掉;重复上述过程直到剩余混合液全部转移离心完;
g)加入500μL SEWS-M，溶解和清洗DNA至SPINTMFilter管中，用移液 枪吹打使沉淀物重新悬浮后以14000×g离心1min;将SPINTMFilter管中的液 体倒掉，再以14000×g离心2min，去除基质中的SEWS-M;
h)将SPINTMFilter放到新的Catch Tube中，于室温下风干5min后加入80μL DES，用移液枪枪头在滤膜上轻轻搅动，使滤膜上的沉淀物重新悬浮后以14000 ×g离心1min，DNA则转移至Catch Tube中;
i)将提取的DNA于-20℃或在4℃保存，用于接下来的PCR扩增及其他 步骤。
优选地，所述的PCR反应体系溶液为25μL，包括：2.5μL 10×PCR缓冲 液，2μL MgCl2，2μL dNTP混合剂，上下引物各0.2μL，0.125μL Ex Taq DNA 聚合酶，2μL DNA模板，即提取的DNA稀释至约20ng/μL，及ddH2O使体系 至25μL。
优选地，使用PCR扩增仪进行扩增，反应温度程序为94℃变性5min后进 入35个循环，每个循环中，先在94℃反应45s，随之在退火温度下反应45s， 之后在72℃下反应90s，循环反应之后再于72℃下反应10min，实验中ARGs 的扩增效率在90%～100%之间，标曲相关系数R2均大于0.99。
优选地，PCR后产物进行琼脂糖凝胶电泳，以观测是否有目标ARGs的扩增 产物，对于含有目标ARGs的PCR产物进行纯化，后进行质粒制备。
优选地，琼脂糖凝胶电泳的具体步骤为：
称取0.3g琼脂糖于锥形瓶中，加入1×TAE 30mL，加热炉加热琼脂糖，加 热均匀后待溶液冷却至30℃左右时向溶液中加入2μL溴化乙锭，随后将溶液 倒入胶床内，插入梳子，放置60min左右待凝胶固化。将凝胶放入电泳槽中， 加入1×TAE溶液，使溶液没过凝胶1-2mm。将1μL Loading Buffer与5μL的 PCR产物混合均匀，加入凝胶中上样孔中。盖上泳槽，接通电源，在100V电 泳25min，电泳结束后，取出凝胶在凝胶成像仪上观测结果。
优选地，PCR产物纯化具体步骤为：
a)在PCR产物溶液中，加入3倍产物体积Buffer PCR-A，混匀后转移至PCR 制备管，将PCR制备管置于提供好的2mL离心管中，以12000×g离心1min， 并弃掉滤液;
b)将PCR制备管置回2mL离心管，加700μL Buffer W2，以12000×g离 心1min，弃滤液。随后加入400μL Buffer W2，以12000×g离心1min;
c)将制备管置于1.5mL洁净离心管，在制备管膜中央加25-30μL Eluent或 去离子水，室温静置1min，随后以12000×g离心1min洗脱DNA。
优选地，使用超微量紫外分光光度计测定PCR产物浓度，计算其摩尔数：
使用pMD 18-T Vector构建ARGs质粒，具体操作如下：
a)在微量离心管中配置5μL体系，包括：1μL pMD 18-T Vector，0.1pmol～0.3 pmol Insert DNA，以及适量的ddH2O使体系至5μL。加入5μL的Solution I， 16℃反应30min;
b)全量即10μL加入至100μL JM109感受态细胞中，冰中放置30min。随 后42℃加热45s后冰中放置1min;
c)加入890μL SOC培养基，37℃振荡培养60min。将100μL培养液转移 至含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养形成单菌落，计数白色、 蓝色菌落;
d)挑选白色菌落使用PCR法确认载体中插入片段长度，使用质粒提取试剂 盒提取菌落质粒。
优选地，ARGs实时定量PCR检测的步骤为：
提取的质粒经10倍稀释后作为qPCR反应的标准品，使用实时定量PCR仪对 检测目标ARGs，每个qPCR反应都含有包括4～5个标准点的标准曲线，20μL 的qPCR的反应体系包括：10μL 2×powerGreen PCR混合染料，上 下引物各0.16μL，2μL模板DNA，提取的DNA稀释至约2ng/μL，7.68μL ddH2O。反应时间温度设置包括95℃反应10min后进入40个循环，每个循 环中，95℃反应15s后在退火温度下反应1min，反应后，仪器根据标准曲 线给出ARGs拷贝数，继而反推至原水中ARGs含量。
优选地，ARGs去除率分析步骤如下：
本发明中基因的浓度单位为单位体积水样中基因的拷贝数，即copies/mL;
其中，j代表特定的基因，包括tetX、tetG、sul或intI1、16S rDNA;
特定基因j处理前在水样中的原始拷贝数(copies/mL);
特定基因j混凝后在水样中的拷贝数(copies/mL);
使用SPSS17.0对数据进行显著性分析。
有益效果：
对于ARGs的去除主要取决于对DNA结构的损伤(胞内DNA及胞外DNA)。
UV及氯化联合技术对ARGs去除的影响如附图2所示，UV辐照后，向污 水中继续投加游离氯(Free Cholride，FC)进行氯化消毒，考察二者的协同作用。 联合消毒的协同作用计算如下：协同作用去除的log值=联合工艺去除的总log 值-单独UV去除的log值-单独氯化去除的log值。在低剂量的UV和氯化作 用下，二者对目标基因的去除均有协同作用，对ARGs、intI1、16S rDNA的去 除可分别增加0.03～0.79log、0.15～1.30log、0.11～0.52log。总体而言，氯化 剂量越小，辐照剂量越大时，协同作用越大。协同作用的产生是因为UV可降 低生物活性，使后续的氯化过程中，有效氯能更易与细胞反应。此外，UV后进 行氯化消毒可以产生持续消毒的作用。
该方法符合城市污水深度处理和回用的需求，符合促进经济、社会和环境 可持续发展的国家重大需求，重点处理废水中毒害污染物--抗生素抗性基因和病 原微生物，利用先进的技术组合，将UV及氯化联合消毒技术应用在废水处理中， 找到了精确的UV及氯化联合技术剂量等操作参数，有效去除抗性基因，为污水 深度处理和水质安全保障提供理论支持和技术保障，填补了国内外所属领域的 技术空白。