申请日2015.03.20
公开(公告)日2015.11.11
IPC分类号C12N1/20; C12N1/19; C12N1/14; C12N15/04; C12N15/01; C12R1/74; C05F7/00; C12R1/11; C12R1/685; C12R1/865; C05F17/00
摘要
本发明主要涉及一种酵母融合菌混菌剂及其发酵有机废水制备液体肥的方法。一种酵母融合菌混菌剂，其主要特点在于由酵母融合菌F105、土著巨大芽孢杆菌B-36、黑曲霉菌A-16组成，其菌群的重量百分比为酵母融合菌55-75%，土著巨大芽孢杆菌20-35%，黑曲霉菌10-15%，所述的酵母融合菌的菌种在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏时间为2014年12月30日，保藏编号为CGMCC?NO.10263，土著巨大芽孢杆菌的菌种在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏时间为2014年12月30日，保藏编号为CGMCC?NO.10264，黑曲霉菌为市场常用菌。酵母融合菌配伍巨大芽孢杆菌、黑曲霉菌三菌组合，制备的酵母融合菌混菌剂，利用该混菌剂发酵有机废水制备液体肥，该产品既可做生物有机肥的发酵剂和助植物生产剂、畜禽鱼饲料添加剂，也可作有机废水处理净化剂，具有多种功能和用途。
CGMCC NO.10263 20141230
摘要附图
权利要求书
1.一种酵母融合菌混菌剂，其特征在于由酵母融合菌F105、土著巨大芽孢杆菌BacillusmegateriumB-36、黑曲霉菌AspergillusnigerA-16组成，其菌群的重量百分比为酵母融合菌55-75%，土著巨大芽孢杆菌20-35%，黑曲霉菌10-15%，所述的酵母融合菌的菌种在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏时间为2014年12月30日，保藏编号为CGMCCNO.10263，土著巨大芽孢杆菌的菌种在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏时间为2014年12月30日，保藏编号为CGMCCNO.10264，黑曲霉菌为市场常用菌。
2.如权利要求1所述的酵母融合菌混菌剂，其特征在于还包括有混菌液体培养基，在1升新鲜豆腐废水或粉丝废水或玉米淀粉或马铃薯淀粉的废水中加1-3g葡萄糖，1-2g硫酸铵，0.5-1mL磷酸，用1%的石灰水调pH至5.5-6.5。
3.如权利要求1所述的酵母融合菌混菌剂，其特征在于所述的酵母融合菌的制备有如下步骤：将酒精酵母菌作母种的斜面菌转种和培养，在液体振荡培养14小时后，用EDTA-巯基乙醇进行预处理，使用1%的纤维素酶和1%蜗牛酶进行酶解脱壁，时间为2小时，温度33℃，得到酒精酵母原生质体;将热带假丝酵母菌作母种的斜面菌转种和培养，在液体振荡培养14小时后，用EDTA-巯基乙醇进行预处理，使用1.5%的纤维素酶和0.5%蜗牛酶进行酶解脱壁，时间为2.5小时，温度33℃，得到热带假丝酵母原生质体;将热带假丝酵母原生质体经0.1%碘乙酸灭活，与酒精酵母原生质体以1:1混合，将沉淀悬于35%聚乙二醇的促溶剂中，30℃水浴静止处理，pH6.0，时间为40min，融合菌液经高渗磷酸缓冲液反复冲洗，涂布于高渗基础培养基和高渗完全培养基平板培养基上，经30℃、7天培养，平板生长出酵母融合菌。
4.如权利要求1所述的酵母融合菌混菌剂，其特征在于所述的土著巨大芽孢杆菌的制备有如下步骤：
(1)采样：土著巨大芽孢杆菌是从兰州市南北两山地区的暗灰钙土、淡灰钙土、红泥土和盐碱土四种不同土壤类型和多个植物根区的0-10cm、10-20cm、20-30cm土壤深度的266份土样;
(2)分离：称取10g新鲜土样，加入盛有100mL无菌水的500mL三角烧瓶，放摇床上振荡10min，使土样均匀地分散在稀释液中成为土壤悬液;经75-80℃水浴中处理15min，吸取1mL上清液加到9mL无菌水中，按10倍法依次稀释至10-4-10-6，各重复4次;在已灭菌的培养皿中倾注15-20mL蒙金娜有机磷细菌琼脂培养基，凝固后用移液枪吸取100μL一定稀释度的土壤稀释液加到培养基表面，然后立即用涂布棒将稀释液涂抹均匀;用相同的方法将同一样本不同稀释度的稀释液从高稀释度到低稀释度依次涂布;将接种稀释液的培养皿倒置放在28-32℃恒温培养箱内培养2-3d后取出，挑取水解圈和菌落直径比例最大的巨大芽孢杆菌菌落，转种在蒙金娜有机磷细菌琼脂斜面试管培养基上，经28-32℃恒温培养2-3d，取出后即为巨大芽孢杆菌母种;
(3)诱变：将此母种再经时间为30s的紫外线照射、亚硝基胍诱变以及生化形态学鉴定，最后将鉴定后获得的菌种再转种于蒙金娜有机磷细菌琼脂斜面试管培养基上，经28-32℃恒温培养2-3d，即得保藏菌种，将此菌种保藏在4-8℃冰箱内备用。
5.如权利要求1所述的酵母融合菌混菌剂的制备方法，其特征在于有如下步骤：
A.琼脂斜面培养基的制备及菌种的培养：
a.酵母融合菌琼脂斜面培养基的制备：
葡萄糖1%、酵母膏1%、蛋白胨0.5%、琼脂粉2%，加水100mL加热溶解后，用1%NaOH调节pH至5.5-6.5，经115℃20分钟蒸汽灭菌，然后分装于15*2cm灭菌的试管中，摆成斜面待凝固后备用;
b.土著巨大芽孢杆菌琼脂斜面培养基的制备：
蒙金娜有机磷细菌培养基：葡萄糖1%、硫酸铵0.05%、NaCl0.03%、硫酸镁0.03%、硫酸亚铁0.003%、硫酸锰0.003%、碳酸钙0.5%、氯化钾0.03%、卵磷脂0.02%、琼脂粉2%，加水100mL加热溶解后用1%NaOH调节pH至7.2-7.4。经115℃20分钟蒸汽灭菌，然后分装于15*2cm灭菌的试管中，摆成斜面待凝固后备用;
c.黑曲霉菌琼脂斜面培养基的制备：
马铃薯—蔗糖琼脂培养基：马铃薯20%、蔗糖2%、琼脂粉2%，加水100mL加热溶解后用1%NaOH调节pH至5.5-6.5。经115℃20分钟蒸汽灭菌，然后分装于15*2cm灭菌的试管中，摆成斜面待凝固后备用;
d.琼脂斜面菌种的制备：
分别取上述三种母种斜面菌种，在无菌条件下，分别转种于上述制备的不同琼脂斜面培养基上，经28-32℃，24-72小时培养，即得斜面菌种为一级菌种;
B.液体培养基及液体菌种的制备：
a.液体培养基的制备：在1升新鲜豆腐废水或粉丝废水或玉米淀粉或马铃薯淀粉的废水中加入葡萄糖1-3g、硫酸铵1-2g、磷酸0.5-1mL，经加热溶解后，用1%石灰水调节pH至5.5-7.0，经115℃20分钟蒸汽灭菌，冷却后备用;
b.将酵母融合菌、土著巨大芽孢杆菌和黑曲霉菌的一级菌种分别接种于装有1000ml液体培养基的1500ml的三角烧瓶中，经28-32℃，24-72小时静置培养，其培养菌种为二级菌种;
c.分别取酵母融合菌、土著巨大芽孢杆菌和黑曲霉菌的二级菌种转种于按步骤a制备10立升液体培养基，并分装于500mL的三角瓶中，每瓶装量120-130mL，以10%的接种量接种液体菌种，上摇床，振幅120-150r/min，经28-32℃，24-72小时培养，其菌种为三级菌种;
d.分别将酵母融合菌、土著巨大芽孢杆菌和黑曲霉菌的三级菌种再转种于按步骤a制备100立升液体培养基装入130立升的发酵罐中，进行菌种的扩大培养，经28-32℃通气搅拌好氧发酵培养24-72小时，其菌种为四级菌种;
e.分别将酵母融合菌、土著巨大芽孢杆菌和黑曲霉菌的四级菌种再转种于按步骤a制备1000立升液体培养基，装入1300立升的发酵罐中再进行菌种的扩大培养，经28-32℃通气搅拌好氧发酵培养24-72小时，其菌种为五级菌种;
f.酵母融合菌混菌剂的制备：将酵母融合菌55-75%，土著巨大芽孢杆菌20-35%，黑曲霉菌10-15%的比例混合即为酵母融合菌混合菌剂。
6.一种如权利要求1所述的酵母融合菌混菌剂发酵有机废水制备液体肥的方法，其特征在于有如下步骤：
a.培养基的制备
在2000立升的发酵罐中装有1500立升新鲜豆腐或粉丝或玉米淀粉或马铃薯淀粉或啤酒或味精或蔬菜加工生产过程中所产生的废水，加入豆粕粉1.3-6.5kg，鱼粉1.3-6.5kg，骨粉0.65-2.6kg，硫酸铵1.3-2.6kg，磷酸0.65-1.3kg，加热溶解后，用1%石灰水调节pH至5.5-6.5，冷却后备用;
b.在上述发酵培养基中加入酵母融合菌混菌剂100-150kg，经充分搅拌混合后，经28-32℃通气搅拌好氧发酵培养48-72小时，经检测活菌细胞数若达10-20亿个/mL，即可放罐，其发酵液为生物液体肥产品。
说明书
酵母融合菌混菌剂及其发酵有机废水制备液体肥的方法
技术领域
本发明主要涉及一种酵母融合菌混菌剂及其发酵有机废水制备液体肥的方法。
背景技术
传统的微生物混菌剂所用微生物菌种，大多是从国家或地方菌种保藏中心购买或直接从自然界采集样本分离筛选出的菌种。其缺点是：1、微生物菌种活性差;2、对有机物分解能力弱;3、利用这些菌种制备的菌剂活细胞数少，大多数在108个/毫升(或克)。
国内已有多种微生物菌剂，如北京的百丰EM、沃土EM和VT菌剂等，前两种EM是用的日本比嘉照夫EM菌种，后者采用菌种库保藏菌和自然界采样分离培养菌，而用原生质体融合技术制备的基因工程菌(酵母融合菌)与土著巨大芽孢杆菌、黑曲霉菌配伍制备酵母融合菌混菌剂尚属空白。
发明内容
本发明的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种酵母融合菌混菌剂。尤其是用原生质体融合技术制备的基因工程菌株(酵母融合菌)与土著巨大芽孢杆菌、黑曲霉菌配伍制备的酵母融合菌混菌剂。
使用基因工程菌(酵母融合菌)与土著巨大芽孢杆菌、黑曲霉菌配伍制备混菌剂所用的液体培养基是有机废水。以新鲜豆腐或粉丝或玉米淀粉或马铃薯淀粉的废水或啤酒废水或味精废水或蔬菜加工废水为原料，在以上废水中加些豆粕、鱼粉、骨粉和无机盐，经混菌剂发酵制成生物液体肥或称氨基酸肥。该方法是利用食品、饮料行业生产中所产生的废水为原料，整个生产过程是在发酵罐中进行，无“三废”污染，生产工艺简单，操作方便，节省人力，节省能源。其产品可做植物生物液体肥，微生物固体菌剂的发酵剂和制备生物有机肥的接种剂，也可做畜禽鱼的液体饲料，有着广泛的作用和用途。
本发明的又一目的在于提供一种酵母融合菌混菌剂发酵有机废水制备液体肥的方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种酵母融合菌混菌剂，其特征在于由酵母融合菌F105、土著巨大芽孢杆菌的(Bacillusmegaterium)B-36、黑曲霉菌(Aspergillusniger)A-16组成，其菌群的重量百分比为酵母融合菌55-75%，土著巨大芽孢杆菌20-35%，黑曲霉菌10-15%，所述的酵母融合菌的菌种在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏时间为2014年12月30日，保藏编号为CGMCCNO.10263，土著巨大芽孢杆菌的菌种在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏时间为2014年12月30日，保藏编号为CGMCCNO.10264，黑曲霉菌为市场常用菌。
所述的酵母融合菌混菌剂，还包括有混菌液体培养基，在1升新鲜豆腐废水或粉丝废水或玉米淀粉或马铃薯淀粉的废水中加1-3g葡萄糖、1-2g硫酸铵，0.5-1mL磷酸，用1%的石灰水调pH至5.5-6.5。
所述的酵母融合菌混菌剂，所述的酵母融合菌的制备有如下步骤：将酒精酵母菌作母种的斜面菌转种和培养，在液体振荡培养14小时后，用EDTA-巯基乙醇进行预处理，使用1%的纤维素酶和1%蜗牛酶进行酶解脱壁，时间为2小时，温度33℃，得到酒精酵母原生质体;将热带假丝酵母菌作母种的斜面菌转种和培养，在液体振荡培养14小时后，用EDTA-巯基乙醇进行预处理，使用1.5%的纤维素酶和0.5%蜗牛酶进行酶解脱壁，时间为2.5小时，温度33℃，得到热带假丝酵母原生质体;将热带假丝酵母原生质体经0.1%碘乙酸灭活，与酒精酵母原生质体以1:1混合，将沉淀悬于35%聚乙二醇(PEG)的促溶剂中，30℃水浴静止处理，pH6.0,时间为40min，融合菌液经高渗磷酸缓冲液(PBS)反复冲洗，涂布于高渗基础培养基(MMS)和高渗完全培养基(YPDS)平板培养基上，经30℃、7天培养，平板生长出酵母融合菌。
所述的土著巨大芽孢杆菌的制备有如下步骤：
(1)采样：土著巨大芽孢杆菌是从兰州市南北两山地区的暗灰钙土、淡灰钙土、红泥土和盐碱土9种不同土壤类型和多个植物根区的0-10cm、10-20cm、20-30cm土壤深度的266份土样
(2)分离：称取10g新鲜土样，加入盛有100mL无菌水的500mL三角烧瓶，放摇床上振荡10min，使土样均匀地分散在稀释液中成为土壤悬液。经75-80℃水浴中处理15min，吸取1mL上清液加到9mL无菌水中，按10倍法依次稀释至10-4-10-6，各重复4次。在已灭菌的培养皿中倾注15-20mL蒙金娜有机磷细菌琼脂培养基，凝固后用移液枪吸取100μL一定稀释度的土壤稀释液加到培养基表面，然后立即用涂布棒将稀释液涂抹均匀。用相同的方法将同一样本不同稀释度的稀释液从高稀释度到低稀释度依次涂布。将接种稀释液的培养皿倒置放在28-32℃恒温培养箱内培养2-3d后取出，挑取水解圈和菌落直径比例最大的巨大芽孢杆菌菌落(革兰氏染色阳性，严格好氧)，转种在蒙金娜有机磷细菌琼脂斜面试管培养基上，经28-32℃恒温培养2-3d，取出后即为巨大芽孢杆菌母种。
(3)诱变：将此母种再经紫外线(30s)、亚硝基胍(NTG)诱变以及生化形态学鉴定，最后将鉴定后获得的菌种再转种于蒙金娜有机磷细菌琼脂斜面试管培养基上，经28-32℃恒温培养2-3d，即得保藏菌种，将此菌种保藏在4-8℃冰箱内备用。
土著巨大芽孢杆菌属于革兰氏阳性杆菌，是严格的好氧菌。在琼脂平板培养基上，细胞形态呈柱状、椭圆形或梨形，菌体大小为1.0-1.2um×2.0-5.0um扭曲短链，在碳水化合物培养基中细胞形态较大。经试验证明土著巨大芽孢杆菌能分解土壤卵磷脂的66%，分解核酸的58%。因土著巨大芽孢杆菌能分泌磷酸脂酶，所以能分解有机磷化合物，为植物提供所必需的磷。
所述的酵母融合菌混菌剂的制备方法，其特征在于有如下步骤：
A.琼脂斜面培养基的制备及菌种的培养
a.酵母融合菌琼脂斜面培养基的制备：
葡萄糖1%、酵母膏1%、蛋白胨0.5%、琼脂粉2%，加水100mL加热溶解后，用1%NaOH调节pH至5.5-6.5，经115℃20分钟蒸汽灭菌，然后分装于15*2cm灭菌的试管中，摆成斜面待凝固后备用;
b.土著巨大芽孢杆菌琼脂斜面培养基的制备：
蒙金娜有机磷细菌培养基：葡萄糖1%、硫酸铵0.05%、NaCl0.03%、硫酸镁0.03%、硫酸亚铁0.003%、硫酸锰0.003%、碳酸钙0.5%、氯化钾0.03%、卵磷脂0.02%、琼脂粉2%，加水100mL加热溶解后用1%NaOH调节pH至7.2-7.4。经115℃20分钟蒸汽灭菌，然后分装于15*2cm灭菌的试管中，摆成斜面待凝固后备用;
c.黑曲霉菌琼脂斜面培养基的制备：
马铃薯—蔗糖琼脂培养基：马铃薯20%、蔗糖2%、琼脂粉2%，加水100mL加热溶解后用1%NaOH调节pH至5.5-6.5。经115℃20分钟蒸汽灭菌，然后分装于15*2cm灭菌的试管中，摆成斜面待凝固后备用;
d.琼脂斜面菌种的制备：
分别取上述三种母种斜面菌种，在无菌条件下，分别转种于上述制备的不同琼脂斜面培养基上，经28-32℃，24-72小时培养，即得斜面菌种为一级菌种;
B.液体培养基及液体菌种的制备：
a.液体培养基的制备：在1升新鲜豆腐废水或粉丝废水或玉米淀粉或马铃薯淀粉的废水中加入葡萄糖1-3g、硫酸铵1-2g、磷酸0.5-1mL，经加热溶解后，用1%石灰水调节pH至5.5-7.0，经115℃20分钟蒸汽灭菌，冷却后备用;
b.将酵母融合菌、土著巨大芽孢杆菌和黑曲霉菌的一级菌种分别接种于装有1000ml液体培养基的1500ml的三角烧瓶中，经28-32℃，24-72小时静置培养，其培养菌种为二级菌种;
c.分别取酵母融合菌、土著巨大芽孢杆菌和黑曲霉菌的二级菌种转种于按步骤a制备10立升液体培养基，并分装于500mL的三角瓶中，每瓶装量120-130mL，经115℃20分钟蒸汽灭菌冷却后，以10%的接种量接种液体菌种，上摇床，振幅120-150r/min，经28-32℃，24-72小时培养，其菌种为三级菌种;
d.分别将酵母融合菌、土著巨大芽孢杆菌和黑曲霉菌的三级菌种再转种于按步骤a制备100立升液体培养基装入130立升的发酵罐中，进行菌种的扩大培养，经28-32℃通气搅拌好氧发酵培养24-72小时，其菌种为四级菌种;
e.分别将酵母融合菌、土著巨大芽孢杆菌和黑曲霉菌的四级菌种再转种于按步骤a制备1000立升液体培养基，装入1300立升的发酵罐中再进行菌种的扩大培养，经28-32℃通气搅拌好氧发酵培养24-72小时，其菌种为五级菌种;
f.酵母融合菌混菌剂的制备：将酵母融合菌55-75%，土著巨大芽孢杆菌20-35%，黑曲霉菌10-15%的比例混合即为酵母融合菌混合菌剂。
一种所述的酵母融合菌混菌剂发酵有机废水制备液体肥的方法，其主要特点在于有如下步骤：
a.培养基的制备
在2000立升的发酵罐中装有1500立升新鲜豆腐或粉丝或玉米淀粉或马铃薯淀粉或啤酒或味精或蔬菜加工生产过程中所产生的废水，加入豆粕粉1.3-6.5kg，鱼粉1.3-6.5kg，骨粉0.65-2.6kg，硫酸铵1.3-2.6kg，磷酸0.65-1.3kg，加热溶解后，用1%石灰水调节pH至5.5-6.5，冷却后备用;
b.在上述发酵培养基中加入酵母融合菌混菌剂100-150kg，经充分搅拌混合后，经28-32℃通气搅拌好氧发酵培养48-72小时，经检测活菌细胞数若达10-20亿个/mL，即可放罐，其发酵液为生物液体肥产品。
本发明的有益效果：
发明人采用先进的单亲灭活原生质体融合技术，对热带假丝酵母(Candidatropicalis)968和酒精酵母(Saecharomycescervsiar)2.399两亲本菌株做融合，构建新的基因工程菌，这些融合菌既具有双亲的生物特性，又具有优于双亲的活性酶，絮凝性和耐高温的生物特性。能充分利用豆腐、粉丝和玉米洋芋淀粉废水中有机物的营养物质进行生长繁殖，现将该菌株保藏在中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNO.10263。
土著巨大芽孢杆菌是从兰州市南北两山地区采集的暗灰钙土、淡灰钙土、红粘土和盐碱土四种不同土壤类型多个植物根区的0-10cm、10-20cm、20-30cm的土壤266份土样中分离培养获得3868菌株，从中筛选优化并经紫外线、亚硝基胍(NTG)诱变和反复驯化培养以及生化形态学鉴定所获得的优良菌株，现保存在蒙金娜有机磷细菌琼脂斜面培养基上，4-8℃冰箱内备用。已将该菌株保藏在中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNO.10264。
酵母融合菌配伍巨大芽孢杆菌、黑曲霉菌三菌组合，巨大芽孢杆菌具有适应性强、耐受性好，能将有机物中的不溶性钾和磷转化为有效磷和速效钾供植物生长;芽孢杆菌具有易生长，抗逆性强，适应广，不但能助植物生长，而且可增强植物的抗病虫害能力;黑曲霉菌能分泌纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶、糖化酶等多种酶，可将有机物的纤维素转化为淀粉和糖，为酵母融合菌和土著巨大芽孢杆菌生长提供营养，经科学配比和独特的发酵工艺，使其菌群在生长过程中产生的有用物质及其分泌物质成为各自或相互生长的基料和原料，通过相互间的共生增殖关系，形成了一个复杂而稳定的微生态系统，发挥了多功能的优势。
酵母融合菌、巨大芽孢杆菌和黑曲霉菌在新鲜的豆腐或粉丝或玉米或洋芋淀粉或啤酒或味精或蔬菜加工产生的废水中，添加少量的有机物和无机盐，直接发酵制备生物液体肥，既节省了培养基的原料，减少原料配制的高压灭菌的工序，节省了能源，也解决了这些行业治污的难题，是一项变废为宝，一举多得的生物技术。
酵母融合菌、巨大芽孢杆菌和黑曲霉菌混合菌剂发酵有机废水制备的液肥既可做制备生物有机肥的发酵微生物菌剂和植物生长剂、畜禽鱼饲料添加剂，也可作为有机废水处理净化剂。
酵母融合菌配伍巨大芽孢杆菌、黑曲霉菌三菌组合，制备的酵母融合菌混菌剂，利用该混菌剂发酵有机废水制备液体肥，该产品既可做生物有机肥的发酵剂和助植物生产剂、畜禽鱼饲料添加剂，也可作有机废水处理净化剂，具有多种功能和用途。
本技术生产原料是食品工业生产时所产生的新鲜废水，添加少量的有机物与无机盐，直接发酵制备生物液体肥，既节省了培养基的原料，减少原料配制的高压灭菌工序，节省了能源，也解决了食品行业的治污难题，是一项变废为宝，一举多得的生物技术。