申请日2015.09.08
公开(公告)日2015.11.18
IPC分类号C12N1/00; C02F3/34
摘要
一种煤焦化废水COD降解用菌种驯化试剂盒及驯化方法，试剂盒包括富集管、驯化预制管A、驯化预制管B，驯化方法包括缺氧和好氧驯化。该试剂盒是通过在全国大量采集煤焦化废水样品，对废水成分进行分析，并通过实验配制出了一种可以模拟真实污水的驯化培养基，并以此为基础形成了试剂盒。该驯化培养基具有较强的适应性，通过其驯化后的菌种投入到多个煤焦化污水样品后，其COD降解能力均有所提高，大大缩短污水处理启动时间。该试剂盒可模拟缺氧、好氧生物法工艺，可应用于煤焦化污水处理菌剂的产品优化，以及污水厂在运行前对污泥进行快速驯化。
摘要附图
权利要求书
1.一种煤焦化废水COD降解用菌种驯化试剂盒，其特征在于：它是由富集 管、驯化预制管A、驯化预制管B组成;其中：
(一)、富集管：
富集管的制备：
(1)、取牛肉膏1-2g，蛋白胨1-2g，磷酸二氢钾640-780mg，磷酸氢二钠 0.75-1.25g，用1L水溶解，以上培养基用浓度5%的碳酸钠和5%HCl调pH至 7.00-7.50，分装到50ml螺口管中，每支管加入培养基20ml;分装完毕后，将 螺口管盖拧松，115℃灭菌25-30min，待灭菌结束并冷却至室温后，从灭菌锅中 取出并拧紧管盖，至此基础富集管制备完成;
(2)、取苯酚18-22mg，萘酚3-7mg，2-甲基苯酚3-7mg，3-甲基苯酚3-7mg， 喹啉1-2mg，用100ml无菌水溶解，溶解后在无菌条件下用0.22μm无菌滤膜过 滤除菌;过滤除菌完成后，取2ml经过过滤除菌的溶液，在无菌条件下加入到 步骤(1)中的基础富集管中，至此富集管制备完成;
(二)、驯化预制管A：
驯化预制管A的制备：
(1)、取牛肉膏0.8-1.2g，蛋白胨0.8-1.2g，丙三醇0.2-0.4ml，磷酸二 氢钾640-780mg，磷酸氢二钠0.75-1.25g，用1L水溶解，以上培养基用浓度5% 的碳酸钠和5%HCl调pH至7.50-8.00，分装到50ml螺口管中，每支管加入培养 基30ml;分装完毕后，将螺口管盖拧松，115℃灭菌25-30min，待灭菌结束并冷 却至室温后，从灭菌锅中取出并拧紧管盖，至此基础驯化预制管A制备完成;
(2)、取苯酚23-27mg，萘酚8-12mg，2-甲基苯酚8-12mg，3-甲基苯酚 8-12mg，喹啉2-4mg，苯胺4-6mg，吡啶0.4-0.6mg，间甲苯胺4-6mg，辛基十 二烷醇0.1-0.2mg，用100ml无菌水溶解，溶解后在无菌条件下用0.22μm无菌 滤膜过滤除菌，过滤除菌后的溶液为水添加物A;
(3)、取萘130-170mg，吲哚230-270mg，甲苯3-7mg，邻苯二甲酸二丁酯 2-3mg，苯并咪唑2-3mg，用100ml75%乙醇溶解，此溶液为醇添加物A;
(4)、分别取水添加物A3ml，醇添加物A0.012ml，在无菌条件下装到步 骤(1)中的基础驯化预制管A中，至此驯化预制管A制备完成;
(三)、驯化预制管B：
驯化预制管B的制备：
(1)、取牛肉膏0.5-0.7g，蛋白胨0.5-0.7g，丙三醇0.6-0.8ml，磷酸二 氢钾640-780mg，磷酸氢二钠0.75-1.25g，用1L水溶解，以上培养基用浓度5% 的碳酸钠和5%HCl调pH至7.50-8.00，分装到50ml螺口管中，每支管加入培养 基30ml;分装完毕后，将螺口管盖拧松，115℃灭菌25-30min，待灭菌结束并冷 却至室温后，从灭菌锅中取出并拧紧管盖，至此基础驯化预制管B制备完成;
(2)、取苯酚150-200mg，萘酚20-25mg，2-甲基苯酚40-50mg，3-甲基苯 酚40-50mg，喹啉8-10mg，苯胺10-15mg，吡啶0.8-0.9mg，间甲苯胺10-15mg， 辛基十二烷醇0.3-0.4mg，用100ml无菌水溶解，溶解后在无菌条件下用0.22 μm无菌滤膜过滤除菌，过滤除菌后的溶液为水添加物B;
(3)、取萘740-760mg，吲哚1200-1300mg，甲苯20-25mg，邻苯二甲酸二 丁酯10-14mg，苯并咪唑10-14mg，用100ml75%乙醇溶解，此溶液为醇添加物B;
(4)、分别取水添加物B3ml，醇添加物B0.012ml，在无菌条件下装到步 骤(1)中的基础驯化预制管B中，至此驯化预制管B制备完成。
2.一种采用权利要求1所述的煤焦化废水COD降解用菌种驯化试剂盒驯化 方法，其特征在于：包括以下步骤：
(一)、缺氧阶段驯化：
(1)、将待驯化样品取1-3ml接种到第1富集管中，将第1富集管的管盖拧 紧，平放入摇床28-35℃、150-200rpm震荡培养24-48小时;
(2)、取经第1富集管培养的样品5ml，接种到第1驯化预制管A中，将第 1富集管连同管内剩余样品放入4℃冷藏;
(3)、将第1驯化预制管A的管盖拧紧，平放入摇床25-30℃、100-150rpm 震荡培养24-48小时;培养完成后静置30-60min，取上清液A130ml放入100ml 经过灭菌的第1三角瓶中，然后放入4℃留存;取沉淀5ml接种到第2驯化预 制管A中继续培养;
(4)将第2驯化预制管A的管盖拧紧，平放入摇床25-30℃、100-150rpm 震荡培养24-48小时;培养完成后静置30-60min，取上清液A230ml放入100ml 经过灭菌的第2三角瓶中，然后放入4℃留存;取沉淀5ml接种到第3驯化预 制管A中继续培养;
(5)将第3驯化预制管A的管盖拧紧，平放入摇床25-30℃、100-150rpm 震荡培养24-48小时;培养完成后静置30-60min，取上清液A330ml放入100ml 经过灭菌的第3三角瓶中，然后放入4℃留存;取沉淀5ml接种到第1驯化预 制管B中继续培养;
(6)、将第1驯化预制管B的管盖拧紧，平放入摇床25-28℃、100-150rpm 震荡培养48-72h;培养完成后静置30-60min，取上清液B130ml放入100mi经 过灭菌的第4三角瓶中，然后放入4℃留存;取沉淀5ml接种到第2驯化预制 管B中继续培养;
(7)、将第2驯化预制管B的管盖拧紧，平放入摇床25-28℃、100-150rpm 震荡培养48-72h;培养完成后静置30-60min，取上清液B230ml放入100ml经 过灭菌的第5三角瓶中，然后放入4℃留存;取沉淀5ml接种到第3驯化预制 管B中继续培养;
(8)、将第3驯化预制管B的管盖拧紧，平放入摇床25-28℃、100-150rpm 震荡培养48-72h;培养完成后静置30-60min，取上清液B330ml放入100ml经 过灭菌的第6三角瓶中，然后放入4℃留存;取沉淀1ml，接种到第2富集管中， 将第2富集管的管盖拧紧，平放入摇床28-35℃、150-200rpm震荡培养24-48 小时;培养后将第2富集管放入4℃保存，或加入4ml无菌甘油，混匀后分装到 冻存管冻存;此驯化后菌种为缺氧驯化菌种;
(二)、好氧阶段驯化：
(9)、当样品经过步骤(5)的第3驯化预制管A培养完成后，将步骤(2) 冷藏的第1富集管取出并恢复室温;待恢复室温6-10h后，取5ml接种到上清 液A3中;将接种后的上清液A3放入摇床25-28℃、150-200rpm震荡培养24-48 小时;培养完成后静置30-60min，弃掉30ml上清液，取沉淀5ml接种到上清液 A2中继续培养;
(10)将接种后的上清液A2放入摇床25-28℃、150-200rpm震荡培养24-48 小时;培养完成后静置30-60min，弃掉30ml上清液，取沉淀5ml接种到上清液 A1中继续培养;
(11)将接种后的上清液A1放入摇床25-28℃、150-200rpm震荡培养24-48 小时;培养完成后静置30-60min，弃掉30ml上清液，取沉淀5ml接种到上清液 B3中;
(12)、将接种后的上清液B3入摇床25-28℃、150-200rpm震荡培养48-72 小时;培养完成后静置30-60min，弃掉30ml上清液，取沉淀5ml接种到上清液 B2中继续培养;
(13)、将接种后的上清液B2入摇床25-28℃、150-200rpm震荡培养48-72 小时;培养完成后静置30-60min，弃掉30ml上清液，取沉淀5ml接种到上清液 B1中继续培养;
(14)、将接种后的上清液B1入摇床25-28℃、150-200rpm震荡培养48-72 小时，培养完成后静置30-60min，弃掉30ml上清液，取沉淀1ml，接种到第3 富集管中;
(15)、将第3富集管的管盖拧紧，平放入摇床28-35℃、150-200rpm震荡 培养24-48小时;培养后将第3富集管放入4℃保存，或加入4ml无菌甘油，混 匀后分装到冻存管冻存;此驯化后菌种为好氧驯化菌种。
说明书
煤焦化废水COD降解用菌种驯化试剂盒及驯化方法
技术领域：
本发明属于一种菌种驯化试剂盒及驯化方法，特别涉及一种用于降解煤焦化 废水COD用菌种驯化试剂盒及驯化方法。
背景技术：
煤焦化又称煤炭高温干馏。以煤为原料，在隔绝空气条件下，加热到950℃ 左右，经高温干馏生产焦炭，同时获得煤气、煤焦油并回收其它化工产品的一种 煤转化工艺。
煤焦化行业造成的水污染相当严重。我国煤炭储量大，煤焦化废水排放量大， 其废水的成分相当复杂，排出的废水中含有大量难以降解的有机污染物，据相关 统计显示，煤焦化废水含有高达300多种污染物质，不论是对环境还是对人类本 身都有着较大的影响。
煤焦化企业排放废水含有大量有毒、有害物质。综合废水中COD一般在5000 mg/L左右，废水所含有机污染物包括酚类、多环芳香族化合物及含氮、氧、硫 的杂环化合物等。废水中的易降解有机物主要是酚类化合物和苯类化合物;可降 解类有机物有砒咯、萘、呋喃、咪唑;难降解的有机物主要有吡啶、咔唑、联苯、 三联苯等。
目前国内处理煤焦化废水的主要工艺路线基本遵行“预处理+生化处理+ 深度处理”，其中生化处理是污水处理工艺的重要阶段。通过对国内多个煤焦化 企业的实地走访，目前对于预处理后的煤焦化废水，一般采用缺氧、好氧生物法 处理(A/O工艺)。微生物是废水生物处理过程的核心，制约着污水处理的效果。 在污水厂启动初期或运行受到冲击需要重新恢复运行时，国内普遍采用的方法是 向污水处理设施中投加污泥和营养物质，或者投加市场上现有的专用微生物菌 剂，达到污水处理设施正常运行的目的。对于煤焦化废水的处理，投加污泥和菌 剂的效果受到以下几方面问题的制约：一、煤焦化废水中含有多种对微生物有毒 害作用的物质，投加到污水中的污泥或菌种中的部分微生物容易被废水中的毒性 物质所抑制，为解决此问题往往需要对污泥或菌种在投加前进行长时间的驯化; 二、煤焦化废水中有大量难降解有机物，这些物质很难被微生物利用并降解，解 决这个问题通常需要工艺的合理设计与污泥或菌剂的驯化共同解决;三、与普通 污水相比，煤焦化废水处理设施的启动时间更长，需要更长时间的驯化。
发明内容：
本发明的目的在于解决以上问题，提供一种煤焦化废水COD降解用菌种驯化 试剂盒及驯化方法，经本试剂盒驯化后的菌种投放到煤焦化废水中，可以大大缩 短污水处理启动时间，提高COD降解效率。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种煤焦化废水COD降解用菌种 驯化试剂盒，其特征在于：它是由富集管、驯化预制管A、驯化预制管B组成; 其中：
(一)、富集管：
富集管的制备：
(1)、取牛肉膏1-2g，蛋白胨1-2g，磷酸二氢钾640-780mg，磷酸氢二钠 0.75-1.25g，用1L水溶解，以上培养基用浓度5%的碳酸钠和5%HCl调pH至 7.00-7.50，分装到50ml螺口管中，每支管加入培养基20ml;分装完毕后，将 螺口管盖拧松，115℃灭菌25-30min，待灭菌结束并冷却至室温后，从灭菌锅中 取出并拧紧管盖，至此基础富集管制备完成;
(2)、取苯酚18-22mg，萘酚3-7mg，2-甲基苯酚3-7mg，3-甲基苯酚3-7mg， 喹啉1-2mg，用100ml无菌水溶解，溶解后在无菌条件下用0.22μm无菌滤膜过 滤除菌;过滤除菌完成后，取2ml经过过滤除菌的溶液，在无菌条件下加入到 步骤(1)中的基础富集管中，至此富集管制备完成;
(二)、驯化预制管A：
驯化预制管A的制备：
(1)、取牛肉膏0.8-1.2g，蛋白胨0.8-1.2g，丙三醇0.2-0.4ml，磷酸二 氢钾640-780mg，磷酸氢二钠0.75-1.25g，用1L水溶解，以上培养基用浓度5% 的碳酸钠和5%HCl调pH至7.50-8.00，分装到50ml螺口管中，每支管加入培养 基30ml;分装完毕后，将螺口管盖拧松，115℃灭菌25-30min，待灭菌结束并冷 却至室温后，从灭菌锅中取出并拧紧管盖，至此基础驯化预制管A制备完成;
(2)、取苯酚23-27mg，萘酚8-12mg，2-甲基苯酚8-12mg，3-甲基苯酚 8-12mg，喹啉2-4mg，苯胺4-6mg，吡啶0.4-0.6mg，间甲苯胺4-6mg，辛基十 二烷醇0.1-0.2mg，用100ml无菌水溶解，溶解后在无菌条件下用0.22μm无菌 滤膜过滤除菌，过滤除菌后的溶液为水添加物A;
(3)、取萘130-170mg，吲哚230-270mg，甲苯3-7mg，邻苯二甲酸二丁酯 2-3mg，苯并咪唑2-3mg，用100ml75%乙醇溶解，此溶液为醇添加物A;
(4)、分别取水添加物A3ml，醇添加物A0.012ml，在无菌条件下装到步 骤(1)中的基础驯化预制管A中，至此驯化预制管A制备完成;
(三)、驯化预制管B：
驯化预制管B的制备：
(1)、取牛肉膏0.5-0.7g，蛋白胨0.5-0.7g，丙三醇0.6-0.8ml，磷酸二 氢钾640-780mg，磷酸氢二钠0.75-1.25g，用1L水溶解，以上培养基用浓度5% 的碳酸钠和5%HCl调pH至7.50-8.00，分装到50ml螺口管中，每支管加入培养 基30ml;分装完毕后，将螺口管盖拧松，115℃灭菌25-30min，待灭菌结束并冷 却至室温后，从灭菌锅中取出并拧紧管盖，至此基础驯化预制管B制备完成;
(2)、取苯酚150-200mg，萘酚20-25mg，2-甲基苯酚40-50mg，3-甲基苯 酚40-50mg，喹啉8-10mg，苯胺10-15mg，吡啶0.8-0.9mg，间甲苯胺10-15mg， 辛基十二烷醇0.3-0.4mg，用100ml无菌水溶解，溶解后在无菌条件下用0.22 μm无菌滤膜过滤除菌，过滤除菌后的溶液为水添加物B;
(3)、取萘740-760mg，吲哚1200-1300mg，甲苯20-25mg，邻苯二甲酸二 丁酯10-14mg，苯并咪唑10-14mg，用100ml75%乙醇溶解，此溶液为醇添加物B;
(4)、分别取水添加物B3ml，醇添加物B0.012ml，在无菌条件下装到步 骤(1)中的基础驯化预制管B中，至此驯化预制管B制备完成。
一种采用煤焦化废水COD降解用菌种驯化试剂盒驯化方法，其特征在于：包 括以下步骤：
(一)、缺氧阶段驯化：
(1)、将待驯化样品取1-3ml接种到第1富集管中，将第1富集管的管盖拧 紧，平放入摇床28-35℃、150-200rpm震荡培养24-48小时;
(2)、取经第1富集管培养的样品5ml，接种到第1驯化预制管A中，将第 1富集管连同管内剩余样品放入4℃冷藏;
(3)、将第1驯化预制管A的管盖拧紧，平放入摇床25-30℃、100-150rpm 震荡培养24-48小时;培养完成后静置30-60min，取上清液A130ml放入100ml 经过灭菌的第1三角瓶中，然后放入4℃留存;取沉淀5ml接种到第2驯化预 制管A中继续培养;
(4)将第2驯化预制管A的管盖拧紧，平放入摇床25-30℃、100-150rpm 震荡培养24-48小时;培养完成后静置30-60min，取上清液A230ml放入100ml 经过灭菌的第2三角瓶中，然后放入4℃留存;取沉淀5ml接种到第3驯化预 制管A中继续培养;
(5)将第3驯化预制管A的管盖拧紧，平放入摇床25-30℃、100-150rpm 震荡培养24-48小时;培养完成后静置30-60min，取上清液A330ml放入100ml 经过灭菌的第3三角瓶中，然后放入4℃留存;取沉淀5ml接种到第1驯化预 制管B中继续培养;
(6)、将第1驯化预制管B的管盖拧紧，平放入摇床25-28℃、100-150rpm 震荡培养48-72h;培养完成后静置30-60min，取上清液B130ml放入100ml经 过灭菌的第4三角瓶中，然后放入4℃留存;取沉淀5ml接种到第2驯化预制 管B中继续培养;
(7)、将第2驯化预制管B的管盖拧紧，平放入摇床25-28℃、100-150rpm 震荡培养48-72h;培养完成后静置30-60min，取上清液B230ml放入100ml经 过灭菌的第5三角瓶中，然后放入4℃留存;取沉淀5ml接种到第3驯化预制 管B中继续培养;
(8)、将第3驯化预制管B的管盖拧紧，平放入摇床25-28℃、100-150rpm 震荡培养48-72h;培养完成后静置30-60min，取上清液B330ml放入100ml经 过灭菌的第6三角瓶中，然后放入4℃留存;取沉淀1ml，接种到第2富集管中， 将第2富集管的管盖拧紧，平放入摇床28-35℃、150-200rpm震荡培养24-48 小时;培养后将第2富集管放入4℃保存，或加入4ml无菌甘油，混匀后分装到 冻存管冻存;此驯化后菌种为缺氧驯化菌种;
(二)、好氧阶段驯化：
(9)、当样品经过步骤(5)的第3驯化预制管A培养完成后，将步骤(2) 冷藏的第1富集管取出并恢复室温;待恢复室温6-10h后，取5ml接种到上清 液A3中;将接种后的上清液A3放入摇床25-28℃、150-200rpm震荡培养24-48 小时;培养完成后静置30-60min，弃掉30ml上清液，取沉淀5ml接种到上清液 A2中继续培养;
(10)将接种后的上清液A2放入摇床25-28℃、150-200rpm震荡培养24-48 小时;培养完成后静置30-60min，弃掉30ml上清液，取沉淀5ml接种到上清液 A1中继续培养;
(11)将接种后的上清液A1放入摇床25-28℃、150-200rpm震荡培养24-48 小时;培养完成后静置30-60min，弃掉30ml上清液，取沉淀5ml接种到上清液 B3中;
(12)、将接种后的上清液B3入摇床25-28℃、150-200rpm震荡培养48-72 小时;培养完成后静置30-60min，弃掉30ml上清液，取沉淀5ml接种到上清液 B2中继续培养;
(13)、将接种后的上清液B2入摇床25-28℃、150-200rpm震荡培养48-72 小时;培养完成后静置30-60min，弃掉30ml上清液，取沉淀5ml接种到上清液 B1中继续培养;
(14)、将接种后的上清液B1入摇床25-28℃、150-200rpm震荡培养48-72 小时，培养完成后静置30-60min，弃掉30ml上清液，取沉淀1ml，接种到第3 富集管中;
(15)、将第3富集管的管盖拧紧，平放入摇床28-35℃、150-200rpm震荡 培养24-48小时;培养后将第3富集管放入4℃保存，或加入4ml无菌甘油，混 匀后分装到冻存管冻存;此驯化后菌种为好氧驯化菌种。
本发明的优点和有益效果是：
该试剂盒是通过本实验室在全国大量采集煤焦化废水样品，对废水成分进行 分析，并通过实验配制出了一种可以模拟真实污水的驯化培养基，并以此为基础 形成了试剂盒。该驯化培养基具有较广的适用性，通过其驯化后的菌种投入到多 个煤焦化污水样品后，可以作为高效煤焦化废水COD处理菌剂或污泥，提高菌种 在废水中的适应能力，其COD降解能力均有所提高，缩短污水处理启动时间。该 试剂盒可以模拟缺氧、好氧生物法工艺，可以应用于煤焦化污水处理菌剂的产品 优化，以及污水厂在运行前对污泥进行快速驯化。