申请日2015.12.19
公开(公告)日2016.04.06
IPC分类号C05F7/00; C05F11/08
摘要
本发明涉及一种利用剑麻废水资源化生产防治植物病害，促进植物生长的解淀粉芽孢杆菌液肥的方法，属于微生物肥料和废水资源化技术领域。该方法主要是以剑麻加工之后的剑麻废水为主要培养基原料，采用液态发酵的方法生产解淀粉芽孢杆菌液肥。直接进行灌装，不产生废水，将剑麻废水得到资源化利用，本发明生产的解淀粉芽孢杆菌液肥用于植物土传病害防治，促进生长，提高产品质量，显示出广阔的应用前景。
权利要求书
1.一种利用剑麻废水生产高效拮抗植物病原菌，促进植物生长的解淀粉芽孢杆菌液肥的方法，其特征在于，生产解淀粉芽孢杆菌液肥包括如下步骤：
A、榨汁，将新鲜剑麻渣压榨，得到剑麻废水;
B、液体菌种制备：取出解淀粉芽孢杆菌菌种保藏管，用LB固体培养基划平板进行复苏，37℃培养48小时;在平板下挑取单个菌落接种50毫升LB培养基中，在培养箱中37℃震荡培养24小时;种子采用5%的接种量，接种至5L大三角瓶中LB培养基，装液量为2L，37℃震荡培养20-28小时，检测其菌液浓度，活菌含量超过10亿CFU/毫升，即可作为解淀粉芽孢杆菌液体菌种;
C、发酵：在1000L发酵罐中抽入600L剑麻废水，用氨水将剑麻废水调PH至7.5-7.8，加入5-10g/L的豆粕粉，在121℃下灭菌15分钟-20分钟，降温至37℃，按5%-10%的接种量接种解淀粉芽孢杆菌液体菌种，开搅拌120r/min，37℃培养24-36小时，前12小时通气量为液/气1：0.8，之后通气量为1：1，待芽孢含量不低于20亿CFU/毫升，即可停止发酵;
D、将发酵的菌液用60目的滤网过滤，将滤液进行无菌罐装，得到成品;
其中，所述LB培养基：蛋白胨5g，牛肉膏3g，氯化钠5g，水1000mL，pH7.2，固体培养基中加入琼脂2%;各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。
说明书
一种利用剑麻废水生产解淀粉芽孢杆菌液肥及其制备方法
技术领域
本明属于微生物菌肥和废水资源化技术领域，具体是本发明涉及一种利用剑麻废水生产解淀粉芽孢杆菌液肥的方法。
背景技术
解淀粉芽孢杆菌在自然界分布广泛，易分离培养，是工业生产上应用较普遍的菌种，主要用于生产各类酶制剂，其能产丰富的淀粉酶与蛋白酶，是一种具有广谱抑菌活性的细菌产生次生代谢产物的能力较强，其分泌的抗生素、抗菌蛋白或多肽类物质等起到较好的生物防治效果。目前,解淀粉芽孢杆菌已被用于新鲜蔬菜保鲜、工业酶生产，环境保护和农业防治等众多领域，解淀粉芽孢杆菌的抑菌谱较广，代谢产物较丰富，能够产生多种抑菌物质。解淀粉芽孢杆菌具有抑制植物病害的能力，可制成生物制剂用于植物花部、叶、枝干、根部以及果蔬釆后病害防治上;使用解淀粉芽孢杆菌的发酵液,对农作物进行喷施、拌种、灌根等,对植物都产生促进生长的功效。也有研究表明,解淀粉芽孢杆菌可治理水环境污染,其能降解被污染的废水中的丁草胺、苯等物质，还能溶解水华鱼腥藻，为水体富营养化的水华治理提供了一些理论依据。基于其应用广泛，其生产培养方法也多种，如：王栋等在专利号：201310017340.0中公开了利用柠檬酸废水低成本生产防治植物病害、促进植物生长的解淀粉芽孢杆菌生防菌剂的方法。中国发明专利：201010518034.1公开了一株解淀粉芽孢杆菌Lx-11菌株，保藏编号为CGMCCNO.3789，对水稻细菌性条斑病有良好的防治效果，培养该菌株采用的培养基为：大豆粉1%，豆饼2%，淀粉0.5%，酵母膏0.2%，玉米浆0.22%，氯化钠0.1%，碳酸氢钙0.18%。中国发明专利：200810231406.5公开了一株解淀粉芽孢杆菌YN-1菌株，保藏编号为CGMCCNO.2328，能有效防治苹果褐斑病，小麦纹枯病等真菌病寄存器，并筛选出了成本低廉的工业用培养基，组成包括：葡萄糖8-12g/L，玉米粉10-16g/L，黄豆姘粉10-16g/L;中国发明专利：201010264520.5公开了一株解淀粉芽孢杆菌TF28菌株，保藏编号为CGMCCNO.4038，它能在植物体内定植、繁殖和传导，可产生抗菌蛋白和脂肽类抗生素两种抗菌物质，具有防病促生作用，其液体培养基每1升由10克胰蛋白胨，5克酵母浸粉，10克氯化钠配制而成。中国发明专利：201110095116.4公开了一株解淀粉芽孢杆菌B-004菌株，保藏编号为CGMCCNO.4557，它对番茄采后早疫病菌具有明显拮抗效果，其培养基中，碳源可为可溶性淀粉，藕粉、葡萄糖、乳糖、海藻糖、蔗糖等，氮源可为蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、硝酸按、氯化铵、硫酸铵等，其他营养源可为含钾、铁、锌、钠、锰、及钙之灯的金属盐等。
而另一方面，剑麻纤维生产加工过程中产生大量的副产品—剑麻废水(剑麻汁)，剑麻废水，是从刮麻机排出的废渣压出的叶汁(回收乱麻渣时要将废渣压干.剑麻废水(叶汁)中所含的化学成分都来自叶片，没有任何外加物质。鲜叶汁含有大量叶肉细胞，呈墨绿色，刚采集的叶汁其酸碱度在PH5左右，放置后PH值迅速下降，叶汁色泽变为黄色并发生沉淀，24小时后PH4左右(保持很久不变)，在堆积的麻渣中流出来的浓麻水为70000毫克每升左右，浓麻水含2%左右的可溶性糖，造成严重的环境污染，影响剑麻产业的可持续发展，而剑麻汁中含有大量的可溶性糖，深度开发这些副产品的潜在价值，对于剑麻产业的经济效益和环境效益，都具有重大的意义。已经有报道可将剑麻废水培养酵母生产单细胞蛋白，但其最后还是有废水排出，并没有完全被利用。
从上面可看出，具有拮抗植物病害的解淀粉芽孢杆菌的菌株较多，其培养方法也各不相同，但是，未见采用剑麻废水培养解淀粉芽孢杆菌的制备方法的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用剑麻废水生产高效拮抗植物病原菌，促进植物生长的解淀粉芽孢杆菌液肥的方法。该方法主要是以剑麻加工之后的剑麻废水为主要培养基原料，采用液态发酵的方法生产解淀粉芽孢杆菌液肥。直接进行灌装，不产生废水，将剑麻废水得到资源化利用，本发明生产的解淀粉芽孢杆菌液肥用于植物土传病害防治，促进生长，提高产品质量，显示出广阔的应用前景。该方法不仅可以低成本地生产环境友好的解淀粉芽孢杆菌液肥，而且为高效处理剑桥麻废水找到有效的资源化处理方法，减少污染物排放，整个生产过程中无污水排出。
为了达到上述目的，本发明提供一种利用剑麻废水生产高效拮抗植物病原菌，促进植物生长的解淀粉芽孢杆菌液肥的方法，其包括如下步骤：
A、榨汁，将新鲜剑麻渣压榨，得到剑麻废水;
B、液体菌种制备：取出解淀粉芽孢杆菌菌种保藏管，用LB固体培养基划平板进行复苏，37℃培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种50毫升LB培养基中，在培养箱中37℃震荡培养24小时。种子采用5%的接种量，接种至5L大三角瓶中LB培养基，装液量为2L，33℃震荡培养20-28小时，检测其菌液浓度，活菌含量超过10亿CFU/毫升，即可作为解淀粉芽孢杆菌液体菌种;
C、发酵：在1000L发酵罐中抽入600L剑麻废水，用氨水将剑麻废水调PH至7.5-7.8，加入5-10g/L的豆粕粉，在121℃下灭菌15分钟-20分钟，降温至37℃，按5%-10%的接种量接种解淀粉芽孢杆菌液体菌种，开搅拌120r/min，37℃培养24-36小时，前12小时通气量液/气为1：0.8，之后通气量为1：1，待芽孢含量不低于20亿/毫升，即可停止发酵;
D、将发酵的菌液用60目的滤网过滤，将滤液进行无菌罐装，得到成品。
采用本方案具有以下优点：
1、剑麻废水中含有丰富的碳源与蛋白质，利用解淀粉芽孢杆菌产生的的淀粉酶与蛋白酶水解剑麻废水中的淀粉与蛋白作为解淀粉芽孢杆菌的营养物质，并经过试验补充一定量的豆粕可以促进解淀粉芽孢杆菌的生长与提高菌数含量;
2、由本发明技术方案生产的解淀粉芽孢杆菌液肥，具有生产成本低，环境友好，芽孢含量高，整个生产过程中无污水产生;
3、该解淀粉芽孢能够有效防治多种土传植物病害，并能够促进作物对养分的吸收和利用，还能提供一定量的有机质，本发明提供的技术方案生产的农用微生物菌肥应用于农业生产可以减少化肥和农药的使用量，从而改善农田环境质量，而且生产成本很低，使高浓度废水得到资源化利用，减少污染物排放。
下面介绍本发明的用剑麻废水生产的解淀粉芽孢杆菌液肥在大田上的一些试验效果(以下简称解淀粉芽孢杆菌液肥)。
实例1解淀粉芽孢杆菌液肥在茄子上的应用效果
1.试验地点：贵州省凤冈县何坝乡白腊洞
2.试验方法：在茄子生长期间，叶面喷施1：500倍解淀粉芽孢杆菌液肥，20天1次，连喷3次;在叶喷施后10天左右用1：1000倍解淀粉芽孢杆菌液肥再灌根一次，对照组用清水喷施;
3.试验结果：试验组比对照组增产13.7%，亩净增收益达164元，最重要的是应用了解淀粉芽孢杆菌液肥后，植株的病害减少了，在整个应用过程中没有使用农药，大大降低了种植成本。
实例2、解淀粉芽孢杆菌液肥在红荔枝上的应用效果
1.试验时间：2014年4月-5月
2.试验地点：广西灵山县石塘乡苏村某农户
3.试验方法：选择生长势中等，花期一致，第二次生理落果基本结束，开始进入果实膨大期的三月红荔枝共20株，10株作试验树，10株作对照;
试验组：用解淀粉芽孢杆菌液肥800倍稀释液于4月18日淋根1次，以后于4月23日、4月28日和5月6日用解淀粉芽孢杆菌液肥500倍稀释液喷树冠3次;解淀粉芽孢杆菌液肥用量为2000ml/亩·次。对照组以清水喷施;
4.试验结果：
、解淀粉芽孢杆菌液肥对果实成熟度的影响
用解淀粉芽孢杆菌液肥处理的三月红果实色泽比CK的鲜红，着色较均匀，成熟度提高1成左右，可提早5—7天上市。解淀粉芽孢杆菌液肥对促进三月红荔枝果实提早成熟有显著的效果;
、解淀粉芽孢杆菌液肥对单果增重效果
使用解淀粉芽孢杆菌液肥处理的三月红荔枝果实裂果少，果大小均匀，病虫害少;试验组单果重均比对照增加，试验组比对照组增加3.16克/枚，增长16.6%;说明解淀粉芽孢杆菌液肥用于荔枝灌根和喷施对其单果增重有一定的促进作用;
、解淀粉芽孢杆菌液肥对荔枝品质风味的影响
用解淀粉芽孢杆菌液肥处理的三月红荔枝果实，肉厚，蜡白色，质中粗稍脆，甜酸适中，微香，口感好;对照组的果实，肉质粗韧、味酸淡、口感差;
从检测的结果看，解淀粉芽孢杆菌液肥的荔枝可溶性固形物含量平均值为17.98%，比CK平均值增长13.4%;
、经济效益分析
用解淀粉芽孢杆菌液肥处理的三月红果实色泽比CK的鲜红，着色较均匀，成熟度提高1成左右，可提早5—7天上市。根据广西三月红荔枝多年上市价格规律，于5月初最早上市的三月红鲜果每公斤价格在20元左右，以后每延长一天每公斤价格下降0.8～1元，最后基本维持在每公斤12～16元之间;
施用解淀粉芽孢杆菌液肥每亩投资约40元，按每亩产三月红鲜果500公斤计，使用解淀粉芽孢杆菌液肥提早上市5～7天，每公斤鲜果可增收4～6元，则每亩可纯增加收入2000～3000元，经济效益十分显著。