申请日2016.01.31
公开(公告)日2016.09.21
IPC分类号C12N1/20; C02F3/34; C12R1/07; C02F103/20
摘要
本发明公开了一种芽胞杆菌HB13000及其在畜禽养殖废水处理中的应用，属于微生物技术领域。所述的芽胞杆菌为甲基营养型芽胞杆菌(Bacillus methylotrophicus)HB13000，分离于海南省八门湾红树林底泥样品。该菌株于2016年1月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.12064。所述芽胞杆菌HB13000具有降解蛋白质、脂肪、淀粉和纤维素活性，能够有效降低畜禽养殖废水的COD值。芽胞杆菌HB13000及其发酵液可以作为一种新的用于畜禽养殖废水处理的微生物资源，在废水处理方面具有良好的应用开发前景。
权利要求书
1.一种芽胞杆菌，其特征在于所述的芽胞杆菌为甲基营养型芽胞杆菌(Bacillusmethylotrophicus)，菌株代号为HB13000，该菌株于2016年1月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC NO.12064。
2.权利要求1所述芽胞杆菌的特征在于，其16S rDNA的序列为：
ACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTCTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGT。
3.一种权利要求1所述的芽胞杆菌的发酵液，其特征在于以所述甲基营养型芽胞杆菌HB13000经菌株活化、种子培养、发酵培养制成。具体包括以下步骤：
(1)菌株活化：将所述的甲基营养型芽胞杆菌HB13000接种于营养琼脂培养基，于30℃培养48～72h。培养基：牛肉膏1～3g/L，蛋白胨5～10g/L，氯化钠1～5g/L，琼脂粉18～20g/L，pH6.5～7.5。
(2)液体培养：将活化的菌株接入液体种子培养基中，于25～35℃、120～200r/min振荡培养18～24h，制成种子液。培养基：牛肉膏1～3g/L，蛋白胨5～10g/L，氯化钠1～5g/L，pH6.5～7.5。
(3)发酵培养：将种子液按体积比5%接种于液体发酵培养基，25～35℃、120～200r/min振荡培养48～72h，即制得甲基营养型芽胞杆菌HB13000的液体菌剂。培养基：牛肉膏1～3g/L，蛋白胨5～10g/L，氯化钠1～5g/L，pH6.5～7.5。
4.权利要求1所述芽胞杆菌的应用，其特征在于该菌具有降解蛋白质、脂肪、淀粉和纤维素的活性。
5.权利要求1所述芽胞杆菌的应用，其特征还在于该菌能够有效降低畜禽养殖废水的COD值。
6.权利要求1所述的芽胞杆菌的应用，其特征在于所述菌株及其发酵液在畜禽养殖废水处理中的应用。
说明书
一株甲基营养型芽胞杆菌及其在畜禽养殖废水处理中的应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及了一种甲基营养型芽胞杆菌HB13000及其在畜禽养殖废水处理中的应用。
背景技术
随着农业结构调整和农业产业化推进，我国规模化、集约化的畜禽养殖业得到迅猛发展，而由此带来的环境污染问题也日益严重，尤其是畜禽养殖场产生的废水，排放量大、有机污染物浓度高，还含有重金属、残留兽药和病原体等污染物，已造成水源、土壤和环境空气的严重污染。据报道，畜禽养殖污染已成为继工业污染、生活污染后的第三大污染源，是我国农村污染的主要原因之一。目前处理畜禽养殖废水污染主要有还田法、自然处理法和生物处理法三种。生物处理法又分为厌氧处理法、好氧处理法以及厌氧-好氧组合法，它是利用微生物将废水中的污染物进行分解与转化，以消除对环境的污染和危害，是一种处理废水的有效方法。
芽胞杆菌是一类需氧或兼性厌氧细菌，能产生抗逆性内生孢子，是常用微生态制剂之一。芽胞杆菌产生的胞外酶可分解淀粉、蛋白质、脂肪等有机物，从而有效降解水体中的氨氮、亚硝酸盐和硫化物等。本发明采用的甲基营养型芽胞杆菌HB13000，分离自海南省八门湾红树林底泥，具有降解蛋白质、脂肪、淀粉和纤维素活性，能有效降低畜禽养殖废水的COD值，可应用于畜禽养殖废水的处理。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有降解蛋白质、脂肪、淀粉和纤维素的甲基营养型芽胞杆菌，该菌株能够有效降低畜禽养殖废水的COD值，可以作为一种新的用于畜禽养殖废水处理的微生物资源。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明所提供的具有降解蛋白质、脂肪、淀粉和纤维素活性的甲基营养型芽胞杆菌HB13000，已于2016年1月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行了菌种保藏，并证明存活，其保藏登记号为CGMCC No.12064。保存地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所。所述芽胞杆菌HB13000属于 细菌域、厚壁菌门、芽胞杆菌纲、芽胞杆菌目、芽胞杆菌科、芽胞杆菌属。
本发明的甲基营养型芽胞杆菌HB13000获得过程为：从海南省八门湾红树林采集底泥样品，样品经梯度稀释后采用80℃水浴处理20min以杀死非芽胞细菌，其后途布于细菌分离培养基平板。再对分离获得的芽胞杆菌进行产蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶与纤维素酶活力测定，最终筛选出同时具备四种酶活性的芽胞杆菌HB13000。
所述的芽胞杆菌HB13000具有以下生物学特性：菌株在营养琼脂培养基上划线培养3d后，菌落呈圆形、光滑湿润，稍隆起;菌体长杆状，可运动。革兰氏染色、VP测定、氧化酶、接触酶实验阳性，MR实验阴性，利用柠檬酸盐，可还原硝酸盐，可水解淀粉、蛋白、脂肪与纤维素，能使明胶液化。
芽胞杆菌HB13000的16S rDNA序列在GenBank的保存号为KU517813。经多相分类鉴定为Bacillus methylotrophicus(甲基营养型芽胞杆菌)。该菌株易于生长，具有降解蛋白、脂肪、淀粉与纤维素的能力，在畜禽养殖废水处理中能有效降低废水的COD值，能够开发成一种新型应用于养殖废水处理的微生物菌剂。
芽胞杆菌HB13000在畜禽养殖废水处理中的应用，包括如下步骤：
(1)菌株活化：将所述的甲基营养型芽胞杆菌HB13000接种于营养琼脂培养基，于30℃培养24h，活化菌株;培养基：牛肉膏1～3g/L，蛋白胨5～10g/L，氯化钠1～5g/L，琼脂粉18～20g/L，pH6.5～7.5。
(2)液体培养：将活化的菌株接入液体种子培养基中，于25～35℃、120～200r/min振荡培养18～24h，制成种子液。培养基：牛肉膏1～3g/L，蛋白胨5～10g/L，氯化钠1～5g/L，pH6.5～7.5。
(3)发酵培养：将种子液按体积比5%接种于液体发酵培养基，25～35℃、120～200r/min振荡培养48～72h，即制得甲基营养型芽胞杆菌HB13000的液体菌剂。培养基：牛肉膏1～3g/L，蛋白胨5～10g/L，氯化钠1～5g/L，pH6.5～7.5。
(4)将液体菌剂以3%～10%的接种量接种于装有畜禽养殖废水(调pH 7.0左右)的锥形瓶中，于25～35℃、100～200r/min条件下摇床培养48～72h。
实验表明，添加芽胞杆菌HB13000CGMCC No.12064能有效降解养殖废水中COD值，处理48h时，COD值由起始的3136mg/L降至295mg/L，COD去除率达到90.6%;处理72h时，COD值降至191mg/L，COD去除率达到93.9%。由此可见，本发明的芽胞杆菌HB13000 CGMCC No.12064可应用于畜禽养殖废水的处理。
下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。