申请日2016.03.12
公开(公告)日2016.06.22
IPC分类号G01N27/327; G01N27/26; C12N11/12
摘要
一种用于污水处理水质毒性预警的复合生物传感器的制备方法，属于环境监测技术领域，其特征在于：利用天然纤维素作为硝化细菌菌群及过氧化氢酶的载体，采用固定技术，制备复合微生物膜，结合氧电极传感器，制备一种新型的可拆式复合传感器。将此种复合传感器应用于污水水质毒性的监测预警中，其能反应污水的污染物毒性状态、过氧化氢产生含量，同时兼顾污水处理系统的溶解氧、耗氧速率、过氧化氢酶活性状态。复合传感器的设计兼顾多指标的测量，大大减少了监测工作量及相应的监测费用。污水毒性状态的监测预警将为污水处理系统的运行提供及时反馈，以便了解系统的真实运行状态，做出相应的调整。
权利要求书
1.一种用于污水处理水质毒性预警的复合生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：选择载体、制备复合微生物载片、制备可拆式复合传感器，具体制备方法如下：
选择载体：
利用天然纤维素，即玉米秸秆作为硝化细菌菌群及过氧化氢酶的载体;
制备复合微生物载片：
将约5g的玉米秸秆粉碎、预处理(酸化和碱化)后，加到20mL的0.5mol/L的NaIO4溶液中，置于恒温器里，在30℃条件下避光反应一定时间后，用0.2mol/L的乙二醇溶液和超纯水冲洗多次，以便除去残余的NaIO4，冲洗完成后待用;在湿态纤维素中，加入5-10g的硝化细菌菌群及5-10g过氧化氢酶，在室温下反应10-12小时后，用超纯水和磷酸盐缓冲液冲洗，冲洗数次后即制得复合微生物载片，保存在冰箱中备用;
制备可拆式复合传感器：
将复合微生物载片固定到PascoCl-6542型氧电极的表面，覆盖在电极原有的氧气透过性膜上。
说明书
用于污水处理水质毒性预警的复合生物传感器的制备方法
技术领域
一种用于污水处理水质毒性预警的复合生物传感器的制备方法，属于环境监测技术领域，尤其涉及污水处理水质毒性预警的方法。
背景技术
随着经济和工业的迅速发展，微生物法俨然已成为水处理的研究热点，但是工业废水和生活污水给微生物处理系统带来了很大的冲击，对其水质进行毒性状态鉴定十分有必要。由于污染物中具有毒性的成分复杂，直接利用传统的理化特性分析不仅过程繁琐，也不能全面地反映多种有毒物质对环境的综合影响。随着微生物固定化技术和微生物传感器的研究和发展，利用特定微生物活体及酶作为识别元件，其对污染物综合毒性存在一定的响应，此原理为污水水质毒性预警指明了方向。
微生物传感器是使用微生物活细胞或细胞碎片作为敏感元件与电化学换能器来制备生物传感器的，其主要由两部分组成：第一部分是微生物及酶，此膜是以微生物或酶与基质以一定的方式固化形成;第二部分是信号转换器(如氧电极、气敏电极或离子选择电极等)。微生物在利用物质进行呼吸或代谢的过程中，将消耗溶液中的溶解氧或产生一些电活性物质。在微生物的数量和活性保持不变的情况下，其所消耗的溶解氧量或所产生的电活性物质的量反映了被检测物质的量，再借助气体敏感膜电极如溶解氧电极、氨电极、二氧化碳电极、或离子选择电极如玻璃电极等检测溶解氧和电活性物质的变化，就可求得待测物质的量，这是微生物传感器的一般原理。
微生物固定化技术是从固定化酶技术发展起来的。微生物固定化技术指采用物理或化学的方法将游离微生物细胞或酶限定于一定空间区域内，使其未游离于水，但仍保持活性，并可反复使用的微生物技术。一般的，微生物固定化方式分为自固定化和微生物人工强化固定。微生物自固定化主要有吸附法和共价结合法，微生物人工强化固定法有交联法和包埋法。以天然纤维素为原料加工而成的微生物载体，具有亲水和亲生物性好、可降解、孔隙率高、比表面积大、孔径适中、成本低廉的特点。
硝化菌在自然界的氮循环中起着非常重要的作用，它们可以通过硝化作用把氨氮化成硝酸盐，反应式主要如下：。硝化菌是专性好氧菌，易受到外界环境因素的影响，重金属、农药、有机污染物等可以通过抑制硝化作用的酶类如氨单加氧酶、轻氨氧化酶、亚硝酸氧化酶而影响这一过程的进行，这一特点常被用作毒性测试中。若污水中的毒物对硝化菌群产生毒性，则其呼吸速率将会减缓，相应的耗氧速率随着变慢。另外，过氧化氢酶是生物体内一种重要的保护性氧化还原酶，能催化H2O2分解为H2O和O2，在细胞中清除H2O2，使其不再进一步产生毒性很大的羟基自由基，对生物体起保护作用，所以利用过氧化氢酶对过氧化氢的专属分解性监测污水中的毒物过氧化氢浓度具有理论可行性。
申请号CN102329744A(2012.01)公开了异养型硝化细菌、包含其的生物传感器、及检测水体毒性的方法，该发明“采用原位多点采样法筛选得到的四种异养型硝化细菌组合成复合菌剂指示剂，固定于载体上制成生物传感器用于水体毒性的检测。根据本发明的检测水体毒性的方法，解决了生物毒性检测连续在线监测的难题，实现了快速检测水体毒性，从而完成对重大环境污染事件风险源识别与监控以及对饮用水、污水、河流、湖泊等水体的生物毒性检测”。
申请号CN103512938A(2014.01)公开了一种可用于即时监测和检测水体生物毒性的电化学传感器及其装置，该发明“包括工作电极、对电极、参比电极、电解池，所述工作电极为高分子固定的微生物电极，所述高分子固定的微生物电极为电极和包覆在电极外的高分子细菌混合层，所述高分子材料为明胶或壳聚糖，所述细菌为大肠杆菌和或酵母菌，所述电极为玻碳电极、金电极、铂电极或硼掺杂金刚石薄膜电极。本发明还公开了可用于即时监测和检测水体生物毒性的电化学传感器的装置。本发明的电化学传感器可即时监测水体生物毒性的改变和检测水体生物毒性大小，达到即时、在线、连续的检测，具有分析灵敏度高、成本低廉、操作简单、便于携带等特点”。
本发明提出一种复合生物传感器的设计方法。此方法为：利用天然纤维素包埋固定高效硝化菌群及过氧化氢酶，制备出一种复合微生物及酶膜，并将其与溶解氧电极结合制成复合生物传感器。此种复合生物传感器可以同时检测污水中污染物毒性及过氧化氢含量状态，同时也可兼顾污水过氧化氢酶、溶解氧及耗氧速率的监测。
发明内容
传统的污水监测过程中，理化特性分析不仅过程繁琐，也不能全面地反映多种有毒物质对环境的综合影响。本发明克服传统方法的缺陷，发明一种用于污水处理水质毒性预警的复合生物传感器的制备方法，采用微生物固定化技术和微生物传感器，利用特定微生物活体及酶作为识别元件，其对污染物综合毒性存在一定的响应，为污水水质毒性预警提供了解决方案。
一种用于污水处理水质毒性预警的复合生物传感器的制备方法，其特征在于，包括：选择载体→制备复合微生物膜→制备可拆式复合传感器，具体制备方法如下：
选择载体：
选择天然纤维素：玉米秸秆作为硝化细菌菌群及过氧化氢酶的载体;
制备复合微生物膜：
将约5g的玉米秸秆粉碎、预处理(酸化和碱化)后，加到20mL的0.5mol/L的NaIO4溶液中，置于恒温器里，在30℃条件下避光反应一定时间后，用0.2mol/L的乙二醇溶液和超纯水冲洗多次，以便除去残余的NaIO4，冲洗完成后待用;在湿态纤维素中，加入5-10g硝化细菌菌群及5-10g过氧化氢酶，在室温下反应10-12小时后，用超纯水和磷酸盐缓冲液冲洗，冲洗数次后即制得微生物载片，保存在冰箱中备用;
制备可拆式复合传感器：
将复合微生物载片固定到PascoCl-6542型氧电极的表面，覆盖在电极原有的氧气透过性膜上。
工作方式：
将未载有微生物载片的氧电极插入装有待测样品的密闭容器中，滴入过氧化氢量，通过其在过氧化氢酶的作用下产生氧气的量的多少，测定过氧化氢酶的活性，然后通过曝气装置向密闭反应器中通入一定的氧气量，一定时间内观察样品中的氧的消耗量，测得耗氧速率值;测完过氧化氢酶活性和耗氧速率以后，在氧电极上贴上可拆式微生物载片，插入装有待测样品的密闭反应器中，通过载体上的过氧化氢酶可消耗样品中的过氧化氢量的大小，通过载体上的硝化细菌群可感知样品中的综合毒性的大小，毒性越大，样品呼吸速率就会减缓;这些指标均通过氧气的形式被氧电极所感知，然后通过氧电极信号转化器变为可视的检测值。
硝化菌群及过氧化氢酶载体为可拆式薄膜，需测量污水毒性和过氧化氢量时，将其固定于氧电极表面上，密闭反应槽可以通过通氧装置、过氧化氢滴定装置进行过氧化氢酶(CAT)及耗氧速率(OUR)、溶解氧的测定。
此种复合传感器应用于污水水质毒性的监测预警中，其能反应污水的污染物毒性状态、过氧化氢产生含量，同时兼顾污水处理系统的溶解氧、耗氧速率、过氧化氢酶活性状态。复合传感器的设计兼顾多指标的测量，大大减少了监测工作量及相应的监测费用。污水毒性状态的监测预警将为污水处理系统的运行提供及时反馈，以便了解系统的真实运行状态，做出相应的调整。