申请日2016.12.17
公开(公告)日2017.04.26
IPC分类号C12Q1/64; C12Q1/02
摘要
本发明公开了一种应用羊角月牙藻测试采油废水生物毒性的方法。以采油废水为测试废水，以羊角月牙藻为测试生物，以96孔微孔板为载体;通过96孔微孔板加样分析方法，加样96h后采用多功能酶标仪测试681nm处羊角月牙藻的吸光值;利用实验组与对照组的吸光值来计算羊角月牙藻的生长抑制率，使用毒性单位分级评价法，判断采油废水的生物毒性。本发明方法操作简单，方便快捷，重现性好，能够广泛适用于测试采油废水的毒性。
摘要附图
权利要求书
1.一种应用羊角月牙藻测试采油废水生物毒性的方法，其特征在于具体步骤为：
(1)将采回的浑浊采油废水用0.45μm滤膜过滤，制得处理后的采油废水，然后置于4℃冰箱保存待用，假设处理后的采油废水的浓度为单位1;
(2)培养羊角月牙藻使其达到对数生长期，得到羊角月牙藻藻液，将其作为工作藻液;
(3)将工作藻液加入到预先设置好采油废水浓度梯度的白色透明96孔微孔板中，制作采油废水和工作藻液的反应体系，每孔总体积为200μL，实验孔每孔含100μL工作藻液和100μL不同浓度的采油废水，空白对照孔每孔含100μL工作藻液和100μL超纯水，为防止产生边缘效应，周边孔每孔含200μL超纯水，相同条件下，每个采油废水浓度进行9次重复实验，并取平均值;
(4)96h后，采用多功能酶标仪测试在波长681nm下羊角月牙藻的吸光值RLU，利用实验组与对照组的吸光值来计算羊角月牙藻的生长抑制率，以采油废水的不同浓度为横坐标，以不同浓度对应的生长抑制率为纵坐标，利用Origin9.0中的Logistic函数对不同浓度采油废水与生长抑制率E进行非线性拟合;
式中：I0为空白对照样的RLU平均值，I为各浓度9次平行样的RLU平均值;最后，利用毒性单位分级评价法，判断采油废水的综合毒性大小;
所述毒性单位分级评价法是指在毒性测试的基础上，将测试结果的EC50转换成TU值以评价废水的毒性大小，具体如下：
则毒性等级和生物毒性分级标准为：当TU<0.4，毒性等级为1，毒性级别为微毒或无毒，污染级别为基本无污染;当0.4≤TU<1，毒性等级为2，毒性级别为低毒，污染级别为轻污染;当1≤TU<10，毒性等级为3，毒性级别为中毒，污染级别为中污染;当10≤TU<100，毒性等级为4，毒性级别为高毒，污染级别为重污染;当TU≥100，毒性等级为5，毒性级别为剧毒，污染级别为严重污染。
说明书
一种应用羊角月牙藻测试采油废水生物毒性的方法
技术领域
本发明属于废水生物毒性检测领域，特别涉及一种应用羊角月牙藻测试采油废水生物毒性的方法。
背景技术
采油废水是油田采油过程中，除作为回注、工艺回掺或其它用途等生产用水以外，需外排的废水。其中含石油类、表面活性剂等高分子难降解有机污染物;具有含盐度高，腐蚀性强，水温高等特点。现存的《污水综合排放标准》(GB 8978-1996)，其中规定了废水排放的理化指标限值，不涉及毒性的排放指标。目前废水生物毒性的检测方法有：发光菌毒性试验，藻类毒性试验，溞类毒性试验，鱼类毒性试验，鸟类毒性试验等。其中，藻类作为废水毒性检验的指示生物，具有快速简便，重现性好的优点。
发明内容
本发明的目的是提供一种应用羊角月牙藻测试采油废水生物毒性的方法。
具体步骤为：
(1)将采回的浑浊采油废水用0.45μm滤膜过滤，制得处理后的采油废水，然后置于4℃冰箱保存待用，假设处理后的采油废水的浓度为单位1。
(2)培养羊角月牙藻使其达到对数生长期，得到羊角月牙藻藻液，将其作为工作藻液。
(3)将工作藻液加入到预先设置好采油废水浓度梯度的白色透明96孔微孔板中，制作采油废水和工作藻液的反应体系，每孔总体积为200μL，实验孔每孔含100μL工作藻液和100μL不同浓度的采油废水，空白对照孔每孔含100μL工作藻液和100μL超纯水，为防止产生边缘效应，周边孔每孔含200μL超纯水，相同条件下，每个采油废水浓度进行9次重复实验，并取平均值。
(4)96h后，采用多功能酶标仪测试在波长681nm下羊角月牙藻的吸光值RLU，利用实验组与对照组的吸光值来计算羊角月牙藻的生长抑制率，以采油废水的不同浓度为横坐标，以不同浓度对应的生长抑制率为纵坐标，利用Origin9.0中的Logistic函数对不同浓度采油废水与生长抑制率E进行非线性拟合。
式中：I0为空白对照样的RLU平均值，I为各浓度9次平行样的RLU平均值;最后，利用毒性单位分级评价法，判断采油废水的综合毒性大小。
所述毒性单位分级评价法是指在毒性测试的基础上，将测试结果的EC50转换成TU值以评价废水的毒性大小，具体如下：
则毒性等级和生物毒性分级标准为：当TU<0.4，毒性等级为1，毒性级别为微毒或无毒，污染级别为基本无污染;当0.4≤TU<1，毒性等级为2，毒性级别为低毒，污染级别为轻污染;当1≤TU<10，毒性等级为3，毒性级别为中毒，污染级别为中污染;当10≤TU<100，毒性等级为4，毒性级别为高毒，污染级别为重污染;当TU≥100，毒性等级为5，毒性级别为剧毒，污染级别为严重污染。
本发明方法操作简单，方便快捷，重现性好，能够广泛适用于测试采油废水毒性。