申请日2016.11.08
公开(公告)日2017.03.08
IPC分类号G01N30/06
摘要
本发明公开一种定量检测污泥中含硫氨基酸的方法。本发明利用将污泥冷干、研磨、过筛制得样品;经过甲酸将污泥中的含硫氨基酸氧化为磺基丙氨酸和蛋氨酸砜;再利用浓盐酸对蛋白质进行水解，采用3kD滤膜对水解液进行超滤除杂提纯;采用邻苯二甲醛为衍生剂，使含硫氨基酸衍生产物具有荧光特性;衍生产物采用高效液相色谱进行定量分析。本方法与常规方法相比，具有操作简单、便利，毒性小，无需使用价格高昂的氨基酸分析仪，检测准确性高、灵敏度高、重复性好等优点。
权利要求书
1.一种定量测定污泥中含硫氨基酸的方法，其特征在于具体步骤如下：
(1)将污泥样品于冷干机冷干，用球磨机对冷干样品进行研磨，而后过筛，低温保存;
(2)将含(半)胱氨酸、蛋氨酸的污泥样品经过甲酸氧化，制备性质稳定的磺基丙氨酸和蛋氨酸砜;
(3)用浓盐酸对污泥氧化液进行水解，水解液经3kD滤膜超滤，去除污泥中大分子杂质，纯化氨基酸;
(4)将污泥中的氨基酸与衍生剂邻苯二甲醛进行衍生反应，生成有荧光吸收的衍生产物;进样针吸取2.5μl，pH=10.2的硼酸缓冲盐溶液，吸取0.5μl污泥氨基酸超滤液，吸取0.5μl邻苯二甲醛衍生剂，吸取3μl空气以最大速率混合6次;吸取32μl，pH=6.5的二水合磷酸二氢钠稀释液，吸取空气18μl以最大速率混合2次，完成氨基酸衍生过程;
(5)将衍生产物用高效液相色谱进行分析，定量检测污泥中的含硫氨基酸。
2.根据权利要求1所述的定量检测污泥中含硫氨基酸的方法，其特征在于步骤(1)具体为：取污泥样品40ml于50ml离心管于-20℃冷冻;将冷冻污泥置于冷干机中，在-40℃条件下冷干3天;将所得污泥冷干样用球磨机于4500rmp条件下研磨10min;将研磨后的污泥样品过200目筛，于-50℃冰箱保存。
3.根据权利要求1所述的定量检测污泥中含硫氨基酸的方法，其特征在于步骤(2)具体为：取步骤(1)所得产物0.0500g于水解管中，加入过甲酸1.5ml，于50℃条件下，水浴氧化30min，得到污泥氧化液;向污泥氧化液中加0.4ml偏重亚硫酸钠溶液，终止氧化反应;所述过甲酸溶液是将30%的过氧化氢溶液与88%的甲酸溶液按照1：9的体积比混合，在常温下放置1h制得，此溶液现用现配;所述偏重亚硫酸钠溶液是将33.6g偏重亚硫酸钠加水定容至100ml制得。
4.根据权利要求1所述的定量检测污泥中含硫氨基酸的方法，其特征在于步骤(3)具体为：向步骤(2)所得产物置于水解管中，加入5.1ml浓度为8.2mol/l的盐酸溶液，向水解管中通氮气30s，密封水解管，将水解管置于105℃烘箱中水解22h;取出水解管，置于室温冷却，开启水解管，将水解管内污泥水解液移入茄形旋转蒸发瓶中，并用1ml浓度为0.1mol/l盐酸洗出残留水解液，反复三次，将污泥水解液于40℃、-10bar条件下，旋转蒸发至干;用0.1mol/l盐酸将茄形旋转蒸发瓶中的氨基酸样品溶出，并定容至10ml;取定容后的水解液400μl于3kD超滤离心管中，在13805g离心力下离心40min，制得污泥氨基酸超滤液;所述8.2mol/l盐酸溶液是将纯盐酸683ml定容至1000ml制得;所述0.1mol/l盐酸溶液是将纯盐酸8.3ml定容至1000ml制得。
5.根据权利要求1所述的定量检测污泥中含硫氨基酸的方法，其特征在于步骤(4)中所述pH=10.2的硼酸缓冲盐溶液，称取2.50g硼酸，加水溶解，于100ml容量瓶定容得0.4mol/l硼酸溶液，用10mol/l氢氧化钠溶液调pH至10.2;所述10mol/l氢氧化钠溶液，称取40g氢氧化钠，加水溶解，于100ml容量瓶定容制得;所述邻苯二甲醛溶液，称取80.0mg邻苯二甲醛，加7ml硼酸缓冲液溶解，再加1ml乙腈、125μl巯基丙酸混匀;所述pH=6.5的二水合磷酸二氢钠稀释液，称取6.2408g磷酸二氢钾，加水溶解，于1000ml容量瓶定容，用10mol/l氢氧化钠调pH为6.5，再加4ml磷酸。
6.根据权利要求1所述的定量检测污泥中含硫氨基酸的方法，其特征在于步骤(5)中高效液相色谱分析中，所述流动相A是将甲醇、乙腈、水按照体积比为45:45:10混合制得，使用前超声脱气30min;所述流动相B是称取2.6408g磷酸二氢钾，加水溶解，于1000ml容量瓶定容，用10mol/l氢氧化钠调pH为6.5制得，使用前过0.22μm滤膜过滤，超声脱气30min;激发波长Ex为340nm、发射波长Em为460nm;所述流动相梯度如下表所示：
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说明书
定量检测污泥中含硫氨基酸的方法
技术领域
本发明属于化学分析检测领域，其是一种操作相对简便、毒性小、成本低、准确性高、灵敏度高的定量检测污泥中含硫氨基酸的方法。
背景技术
近年来，污水处理厂引发的恶臭问题越来越引起人们的重视。其中，含硫物质在导致恶臭的产生中起到重要作用。在污水处理厂中，厌氧消化过程中所产生的挥发性有机硫(VOSCs)，如甲硫醇(MM)、二甲基硫醚(DMS)等，无机硫，如硫化氢(H2S)等已被确定为引起恶臭的最主要物质。这类物质臭阈值极低，且其产生的恶臭非常严重，即使微量的VOCS和H2S也能对恶臭污染产生极大的贡献。研究表明，在市政污泥的厌氧消化阶段，形成VOSCs的前体物质主要为半胱氨酸(Cys)和甲硫氨酸(Met)。在厌氧条件下，这些含硫的前体物质经过一系列机制，如，生物还原、水解、甲基化、金属催化氧化等转化为VOSCs和H2S。Met会产生MM，MM经过两条途径转化为H2S：其一，不经DMS过程直接由MM转化为H2S;其二，先由 MM 氧化为DMS，DMS再通过产甲烷菌作用产生H2S。而Cys不参与中间VOSCs的形成，直接经微生物作用产生H2S。因此，明确硫元素在厌氧消化过程中的物质流，为后续控制恶臭过程提供理论依据，必需建立适当的方法定量检测污泥中的Cys和Met。
含硫氨基酸的检测主要有液相色谱法、离子色谱法、气相色谱法、电化学法、毛细管电泳法等。其中，高效液相色谱法和离子色谱法较为常用。其中，由离子色谱原理制造的氨基酸分析仪是目前国家标准中规定使用的分析仪器。但由于氨基酸分析仪专属性强、检测成本高，故使用的普及率较低。目前针对含硫氨基酸的检测主要集中于食品及医学领域，针对复杂的环境样品，如污水和污泥中含硫氨基酸的检测尚未见报道。
发明内容
本发明是为了弥补当前污泥物料中含硫氨基酸检测的空缺和技术问题，提供一种切实可行、检测成本低、灵敏度高、准确性高、毒性小的定量检测复杂环境样品污泥中含硫氨基酸的方法。
本发明提出的一种定量测定污泥中含硫氨基酸的方法，具体步骤如下：
(1)将污泥样品于冷干机冷干，用球磨机对冷干样品进行研磨，而后过筛，低温保存;
(2)将含(半)胱氨酸、蛋氨酸的污泥样品经过甲酸氧化，制备性质稳定的磺基丙氨酸和蛋氨酸砜;
(3)用浓盐酸对污泥氧化液进行水解，水解液经3kD滤膜超滤，去除污泥中大分子杂质，纯化氨基酸;
(4)将污泥中的氨基酸与衍生剂邻苯二甲醛进行衍生反应，生成有荧光吸收的衍生产物;进样针吸取2.5μl，pH=10.2的硼酸缓冲盐溶液，吸取0.5μl污泥氨基酸超滤液，吸取0.5μl邻苯二甲醛衍生剂，吸取3μl空气以最大速率混合6次;吸取32μl，pH=6.5的二水合磷酸二氢钠稀释液，吸取空气18μl以最大速率混合2次，完成氨基酸衍生过程;
(5)将衍生产物用高效液相色谱进行分析，定量检测污泥中的含硫氨基酸。
本发明中，步骤(1)具体为：取污泥样品40ml于50ml离心管于-20℃冷冻;将冷冻污泥置于冷干机中，在-40℃条件下冷干3天;将所得污泥冷干样用球磨机于4500rmp条件下研磨10min;将研磨后的污泥样品过200目筛，于-50℃冰箱保存。
本发明中，步骤(2)具体为：取步骤(1)所得产物0.0500g于水解管中，加入过甲酸1.5ml，于50℃条件下，水浴氧化30min，得到污泥氧化液;向污泥氧化液中加0.4ml偏重亚硫酸钠溶液，终止氧化反应;所述过甲酸溶液是将30%的过氧化氢溶液与88%的甲酸溶液按照1：9的体积比混合，在常温下放置1h制得，此溶液现用现配;所述偏重亚硫酸钠溶液是将33.6g偏重亚硫酸钠加水定容至100ml制得。
本发明中，步骤(3)具体为：向步骤(2)所得产物置于水解管中，加入5.1ml浓度为8.2mol/l的盐酸溶液，向水解管中通氮气30s，密封水解管，将水解管置于105℃烘箱中水解22h;取出水解管，置于室温冷却，开启水解管，将水解管内污泥水解液移入茄形旋转蒸发瓶中，并用1ml浓度为0.1mol/l盐酸洗出残留水解液，反复三次，将污泥水解液于40℃、-10bar条件下，旋转蒸发至干;用0.1mol/l盐酸将茄形旋转蒸发瓶中的氨基酸样品溶出，并定容至10ml;取定容后的水解液400μl于3kD超滤离心管中，在13805g离心力下离心40min，制得污泥氨基酸超滤液;所述8.2mol/l盐酸溶液是将纯盐酸683ml定容至1000ml制得;所述0.1mol/l盐酸溶液是将纯盐酸8.3ml定容至1000ml制得。
本发明中，步骤(4)中所述pH=10.2的硼酸缓冲盐溶液，称取2.50g硼酸，加水溶解，于100ml容量瓶定容得0.4mol/l硼酸溶液，用10mol/l氢氧化钠溶液调pH至10.2;所述10mol/l氢氧化钠溶液，称取40g氢氧化钠，加水溶解，于100ml容量瓶定容制得;所述邻苯二甲醛溶液，称取80.0mg邻苯二甲醛，加7ml硼酸缓冲液溶解，再加1ml乙腈、125μl巯基丙酸混匀;所述pH=6.5的二水合磷酸二氢钠稀释液，称取6.2408g磷酸二氢钾，加水溶解，于1000ml容量瓶定容，用10mol/l氢氧化钠调pH为6.5，再加4ml磷酸。
本发明中，步骤(5)中高效液相色谱分析中，所述流动相A是将甲醇、乙腈、水按照体积比为45:45:10混合制得，使用前超声脱气30min;所述流动相B是称取2.6408g磷酸二氢钾，加水溶解，于1000ml容量瓶定容，用10mol/l氢氧化钠调pH为6.5制得，使用前过0.22μm滤膜过滤，超声脱气30min;激发波长Ex为340nm、发射波长Em为460nm;所述流动相梯度如表1所示：
表1：
本发明的有益效果在于：本发明是将复杂环境样品污泥冷干、过筛保存，检测时将污泥样品中的半胱氨酸(胱氨酸)、蛋氨酸经过甲酸氧化，将其转化为磺基丙氨酸和蛋氨酸砜，再经酸水解将氧化产物磺基丙氨酸和蛋氨酸砜从多肽和蛋白质中释放出来，污泥水解样品经超滤除杂提纯，纯化样品与邻苯二甲醛进行在线衍生反应，衍生产物经色谱柱进行高效液相色谱分析。无需使用价格昂贵的氨基酸分析仪，毒性小，切实可行、检测成本低、灵敏度高、准确性高。