申请日2017.03.15
公开(公告)日2017.07.07
IPC分类号C12N1/12; C12N1/16; C02F3/34; C02F3/32; C12R1/645; C12R1/74
摘要
本发明提供一种小球藻和酵母共培养净化酵母废水的方法，包括如下步骤：1)小球藻和酵母细胞活化培养，得到小球藻种子液I和酵母种子液I;2)将小球藻种子液I接种于改良基础培养基，酵母种子液I接种于培养基，置于室外进行种子液培养，得到小球藻种子液II和酵母种子液II;3)将小球藻种子液II粘红酵母种子液II接种于需处理的酵母废水中，形成共培养体系，进行室外共培养。本发明通过三个简单步骤，使用少量的原料，利用自然条件下的光能，不仅能够有效降低小球藻和酵母共培养的能耗和生产成本，而且实现了利用微生物共培养大规模处理酵母废水。
摘要附图
权利要求书
1.一种小球藻和酵母共培养净化酵母废水的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)小球藻和酵母细胞活化培养，得到小球藻种子液I和酵母种子液I;
2)将小球藻种子液I接种于改良基础培养基，酵母种子液I接种于培养基，置于室外，进行种子液培养，得到小球藻种子液II和酵母种子液II;
3)将小球藻种子液II和酵母种子液II接种于需处理的酵母废水中，形成共培养体系，进行室外共培养。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述改良基础培养基的配方包括如下组分：NaNO3 3450-4050mg/L，KH2PO4 1150-1350mg/L，MgSO4·7H2O 900-1100mg/L，EDTA 450-650mg/L，H3BO3 105-125mg/L，CaCl2·2H2O 101-121mg/L，FeSO4·7H2O 45-55mg/L，ZnSO4·7H2O 80-96mg/L，MnCl2·4H2O 13-15mg/L，Na2MoO4·2H2O 11-13mg/L，CuSO4·5H2O 14.5-16.5mg/L，Co(NO3)2·6H2O 4.5-5.5mg/L，C6H12O6 45-55g/L;所述改良基础培养基的pH为6.10±0.2。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中小球藻种子液I和酵母种子液I的培养的条件为：培养温度为27-29℃，光照强度为1500-3400lux，培养周期为6-8天;小球藻种子液I的培养转速为150-210r/m，酵母种子液I的培养转速为90-150r/m。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)按照如下方法进行：
第一阶段：调节酵母废水的pH值为5.8-6.3，取酵母废水总量的25%-35%，并向其中接种小球藻种子液II和酵母种子液II，形成共培养体系，培养周期为4-6天;
第二阶段：补加入酵母废水总量的25%-35%，培养周期为2-4天;
第三阶段：再补加入剩余的酵母废水，培养周期为2-4天。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述小球藻种子液II和所述酵母种子液II的接种比例为2-8∶1。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)按照如下方法进行：
第一阶段：将酵母种子液II接种于酵母废水中，且酵母废水的量为酵母废水总量的25%-35%，待接种有酵母种子液II的酵母废水的pH值上升为4.7-5.7，接入小球藻种子液II，形成共培养体系，培养周期为3-5天;
第二阶段：补加入酵母废水总量的18%-28%，培养周期为2-3天;
第三阶段：再补加入剩余的酵母废水，培养周期为5-6天。
7.根据权利要求1、4、6任意一项所述的方法，其特征在于，步骤3)中，培养温度为26-35℃。
8.根据权利要求1、4、6任意一项所述的方法，其特征在于，步骤3)中，当所述共培养体系的总磷含量少于40mg/L或磷酸根含量少于10mg/L时，加入磷酸盐。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述小球藻包括蛋白核小球藻、普通小球藻、椭圆小球藻、原壳小球藻中的一种;所述酵母包括粘红酵母、斯氏油脂酵母、解脂复膜孢酵母、深红酵母、红法夫酵母、热带假丝酵母、罗伦隐球酵母、圆红冬孢酵母中的一种。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中酵母种子液I接种于培养基，所述的培养基为YM培养基、麦芽汁培养基中的一种。
说明书
一种小球藻和酵母共培养净化酵母废水的方法
技术领域
本发明属于细胞培养技术，涉及微藻和酵母共培养技术，主要涉及一种通过小球藻和酵母共培养净化酵母废水的方法。
背景技术
酵母废水是在酵母生产过程中产生的一种难处理、色度深的高浓度有机废水，具有高含量COD、BOD5、总氮、总磷、不可生物降解的有机污染物和高色度等特点。随着生物制药厂规模扩大，产生的酵母发酵废水量增多，对环境造成了极大污染。研究高效环保的处理方法对酵母行业的可持续发展至关重要。
小球藻是在城市废水处理中应用广泛的藻种，具有生长速率快、耐受能力强、蛋白质或油脂含量高等优点，能利用废水中的碳、氮、磷合成自身细胞组分，有效去除废水中氮磷等营养物质。酵母则能有效去除废水中的有机物质，COD去除率高达68%-86%，且酵母生长较快，培养周期短。有研究表明，微藻和酵母在同一培养体系中存在互利共生的关系，微藻生长产生O2可促进酵母生长;酵母可以分泌强大的胞外酶系降解大分子有机无为小分子，呼吸产生的CO2可为微藻生长所用，从而有效缓解培养过程中pH和溶解氧等变化的影响。微藻和酵母在酵母废水中共培养可以充分利用两种微生物的优势，收获有价值的生物质，同时净化废水，变废为宝。
目前，虽然微藻和酵母共培养积累油脂及处理废水方面的研究已受到广泛关注，但是利用微生物共培养技术规模化处理废水的研究相对较少。例如，公开号为CN102080119的中国专利申请，公开了利用工业废水为培养基，混合培养酵母和藻类，生产微生物油脂的方法;苗金鑫等，味精废水中粘红酵母和钝顶螺旋藻混合培养生产油脂(北京化工大学报，第34卷增刊II，2007年)。不过，上述研究均属于微生物室内共培养，小规模处理废水。
因此，开发一种采用微生物室外共培养规模化处理酵母废水的方法实属必要。
发明内容
为了克服现有技术中的不足，本发明提供一种利用小球藻和酵母室外共培养模式，大规模处理酵母废水的方法;且该方法相对简单，在室外自然条件下培养，能够有效降低能耗和生产成本;在利用微生物共培养，提高酵母废水净化效果方面具有重要实用价值。
为解决上述问题，采用的技术方案如下：
一种小球藻和酵母共培养净化废水的方法，包括如下步骤：
1)小球藻和酵母细胞活化培养，得到小球藻种子液I和酵母种子液I;
2)将小球藻种子液I接种于改良基础培养基，酵母种子液I接种于培养基，置于室外，进行种子液培养，得到小球藻种子液II和酵母种子液II;
3)将小球藻种子液II和酵母种子液II接种于酵母废水中，形成共培养体系，进行室外共培养。
室外种子液培养，利用自然界的光能，对种子液进行大规模、进一步地活化培养，能在短时间内获得大量高密度种子液。
小球藻和酵母共培养进行大规模废水处理，需要大量高密度种子液，若不能提供足够的种子液，接种密度过低，不利于废水净化。本申请发明人发现，直接进行小球藻和酵母共培养不能获得高密度的种子液，所以一开始没有将小球藻和酵母直接共培养;而将小球藻和酵母分别用不同的培养基进行活化及种子液培养，可以在短时间内获得大量高密度种子液。培养种子液I和种子液II实质上是相同的，都是为室外大规模培养提供高密度种子液。种子液I是在实验室培养，而在实验室很难满足大规模种子液的需求。为了快速扩种，提供大量稳定高密度种子液，先在实验室活化培养，之后在室外大摇床进行扩大培养。
所述小球藻包括蛋白核小球藻、普通小球藻、椭圆小球藻、原壳小球藻中的一种;所述酵母包括粘红酵母、斯氏油脂酵母、解脂复膜孢酵母、深红酵母、红法夫酵母、热带假丝酵母、罗伦隐球酵母、圆红冬孢酵母中的一种。
优选的，小球藻为蛋白核小球藻，酵母为粘红酵母。经筛选配对研究，本申请发明人发现蛋白核小球藻和粘红酵母共培养处理酵母废水效果最佳。
所述改良基础培养基的配方为NaNO33450-4050mg/L，KH2PO41150-1350mg/L，MgSO4·7H2O 900-1100mg/L，EDTA 450-650mg/L，H3BO3105-125mg/L，CaCl2·2H2O 101-121mg/L，FeSO4·7H2O 45-55mg/L，ZnSO4·7H2O 80-96mg/L，MnCl2.4H2O 13-15mg/L，Na2MoO4·2H2O 11-13mg/L，CuSO4·5H2O14.5-16.5mg/L，Co(NO3)2·6H2O 4.5-5.5mg/L，C6H12O645-55g/L;所述改良基础培养基的pH6.10±0.2。
优选的，所述改良基础培养基的配方为NaNO33750mg/L，KH2PO41250mg/L，MgSO4·7H2O 1000mg/L，EDTA 500mg/L，H3BO3114.2mg/L，CaCl2·2H2O 111mg/L，FeSO4·7H2O49.8mg/L，ZnSO4·7H2O 88.2mg/L，MnCl2·4H2O 14.2mg/L，Na2M0O4·2H2O 11.92mg/L，CuSO4·5H2O 15.7mg/L，Co(NO3)2·6H2O 4.9mg/L，C6H12O650g/L;所述改良基础培养基的pH6.10。
改良基础培养基中NaNO3的用量是普通培养基的3倍，同时添加葡萄糖作为碳源。在葡萄糖浓度为50g/L、硝酸钠浓度为3.75g/L时，异养培养4天，葡萄糖即可全部耗尽，此时小球藻的生物量浓度达到最高，生物量浓度为21.31g/L，显著高于硝酸钠浓度1.25g/L时所能达到的最大生物量浓度13.64g/L。可见，使用改良基础培养基能促进小球藻的生长，显著提高小球藻的生物量浓度，实现快速扩种，为室外废水的规模处理提供稳定的高密度种子液。
作为一种具体实施方式，步骤2)中酵母种子液I接种于培养基，所述的培养基为YM培养基、麦芽汁培养基中的一种。
优选的，步骤2)中酵母种子液I接种于培养基，所述的培养基为YM培养基。
所述YM培养基的配方为酪蛋白胨5.0g/L、麦芽浸粉3.0g/L、葡萄糖10.0g/L、酵母浸粉3.0g/L，所述YM培养基的pH值6.2±0.2(25℃)。酵母在YM培养基中生长较快，可在短时间内获得高密度种子液，其用量明显少于麦芽汁培养基。考虑到大规模种子液的需求及成本，YM培养基更适合。
以下为步骤1)的优选方案：
将小球藻接种于改良基础培养基，酵母细胞接种于YM培养基，进行细胞活化培养。所述细胞活化培养的条件为：培养温度为恒温27-29℃，转速为140-160r/m，光照强度为3500-4500lux，培养周期为5-7天。
特别优选的，步骤1)中，所述细胞活化培养的条件为：培养温度为恒温28℃，转速为150r/m，光照强度为4000lux，培养周期为6天。
以下为步骤2)的优选方案：
将小球藻种子液I接种于改良基础培养基，酵母种子液I接种于YM培养基，置于室外进行种子液培养，得到小球藻种子液II和酵母种子液II;所述种子液培养的条件为：培养温度为27-29℃，小球藻种子液培养转速为150-210r/m，酵母种子液培养转速为90-150r/m，光照强度为1500-3400lux，培养周期为6-8天。
特别优选的，步骤2)中，所述种子液培养的条件为培养温度为28℃，小球藻种子液培养转速为180r/m，酵母种子液培养转速为120r/m，光照强度为1500-3400lux，培养周期为6-8天。
小球藻种子液培养转速比酵母种子液培养转速高，是因为小球藻在室外摇瓶中密度较高，如果转速过低，可能会有细胞沉降，不利于其生长;在室外培养酵母，酵母生长较快，密度高，由于培养基中含有较多蛋白质，酵母生长产生CO2，如果转速过高，摇瓶里会有大量泡沫产生，不利于酵母的生长，因此转速不宜过高。种子液培养转速可根据实际条件及细胞生长状况进行调节的。
以下为步骤3)的优选方案：
方案一：
第一阶段：取酵母废水总量的25%-35%(体积)，调节酵母废水的pH值为5.8-6.3，并向其中接种小球藻种子液II和酵母种子液II，形成共培养体系，培养周期为4-6天;
第二阶段：补加入酵母废水总量的25%-35%(体积)，培养周期为2-4天;
第三阶段：再补加入剩余的酵母废水，培养周期为2-4天。
从第一阶段到第三阶段，培养温度控制在26-35℃;将培养的pH值控制在6.0-7.0;每天取样测定废水中磷酸盐及总磷含量，当培养体系总磷含量少于40mg/L或磷酸根含量少于10mg/L时，根据剩余磷酸盐和总磷量，补加20-80mg/L PO43--P的磷酸盐，磷酸盐为磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠中的至少一种。
磷是小球藻和酵母生长不可或缺的元素，磷缺乏或不足时不利于细胞生长，进而影响废水净化效果。酵母废水中磷酸盐含量不高，为了保证细胞正常生长，需要补加磷酸盐。
优选的，所述小球藻种子液II和酵母种子液II接种于酵母废水中的比例为2-8∶1。
特别优选的，所述小球藻种子液II和酵母种子液II接种于酵母废水中的比例为3-5∶1。
其中，所述小球藻种子液II和酵母种子液II接种于酵母废水中的比例为细胞数比例。
使用优选的小球藻种子液II和酵母种子液II接种比例，可缓解培养初期pH降低对小球藻生长的影响;不仅可以获得更多有用的小球藻和酵母，而且可以更好地去除酵母废水中COD、NH3-N、TN、TP和PO43-等物质。
方案二：
第一阶段：将酵母种子液II接种于酵母废水中，且酵母废水的量为酵母废水总量的25%-35%(体积)。培养至pH值上升为4.7-5.7，接入小球藻种子液II，形成共培养体系，培养周期为3-5天;
第二阶段：补加入酵母废水总量的18%-28%(体积)，培养周期为2-3天;
第三阶段：再补加入剩余的酵母废水，培养周期为5-6天。
从第一阶段到第三阶段，培养温度控制在26-35℃;将培养的pH值控制在6.0-7.0;每天取样测定废水中磷酸盐及总磷含量，当培养体系总磷含量少于20-40mg/L或磷酸根含量少于10mg/L时，根据剩余磷酸盐和总磷量，补加20-80mg/L PO43--P的磷酸盐，磷酸盐为磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠中的至少一种。
优选的，所述酵母废水为经过砂滤、活性炭过滤、超滤三级预处理过的糖蜜酵母废水。原酵母废水中有机物含量高、废水色值高;若在原废水中直接培养小球藻，由于透光性很差、光合效率低，小球藻生长慢、细胞密度低。通过预处理，可以降低酵母废水的有机物浓度和色度，提高共培养效果，同时提高废水净化能力。预处理过的酵母废水：pH值为3.0-5.5;酵母废水中COD、NH3-N、TN和TP含量分别为10000-15000、300-1000、450-1800和50-200mg/L。但是，由于每批次废水浓度可能不同，范围波动可能更大。
步骤3)的优选方案一具有较高的酵母废水的净化效果，酵母废水中COD、NH3-N、TN、TP、PO43-和BOD5的总去除率可分别高达80.98%、78.54%、83.21%、100%、100%和87.76%。
步骤3)的优选方案二的步骤更为简单，简化了先调节酵母废水的pH值的步骤;而采用先接种酵母种子液II，利用酵母的生长降解大分子有机物(尤其是残余蛋白)，只是氨基氮含量升高，提升了酵母废水的pH值;再接种小球藻。不仅步骤简单，减少成本，更适合工业化应用，而且也能达到很好的酵母废水的净化效果，酵母废水中COD、NH3-N、TN、TP和PO43-的总去除率可分别高达81.57%、67.27%、76.94%、100%和100%。另外，步骤3)的优选方案一、二均采用逐步补加酵母废水的方法。逐步补加酵母废水相当于先利用部分酵母废水进行小球藻和酵母种子液培养，短时间内获得高密度共培养细胞，且该细胞是经过酵母废水驯化的细胞，更加适合在酵母废水中生长。这不仅缩短了室外共培养的培养周期，也提高酵母废水净化效果。另一方面，随着培养时间的延长，酵母废水中小球藻和酵母的细胞数不断增加，需要更多的氮磷等营养物质，通过逐步补加酵母废水可以为细胞生长提供更充足的营养物质，也提高了废水处理量。
室外共培养结束后，通过超滤膜组件偶联管道光生物反应器实现小球藻和酵母的在线浓缩和废水回收。小球藻和酵母浓缩液可以作为种子液继续用于废水处理，也可以进一步浓缩干燥用于其他用途;废水可经适当处理后排放。
本发明具有如下优点和有益效果：
1、本发明技术方案的步骤简单，采取室内种子液培养及室外自然条件下种子液培养和共培养，使用少量的原料，利用自然条件下的光能，不仅能够有效降低小球藻和酵母共培养的能耗和生产成本，而且实现了利用微生物共培养大规模处理酵母废水。
2、与小球藻或酵母单独培养处理酵母废水相比，共培养可以充分利用两种微生物的互利共生的特点，有效缓解培养过程中可能产生的不利因素，特别是在pH和溶氧调节方面。小球藻生长产生氧气，过高浓度的溶解氧会给小球藻带来氧损伤;酵母生长产生CO2，同时会产生有机酸等小分子有机物。共培养中小球藻光合作用释放的氧气可以被酵母细胞利用，酵母呼吸作用产生的CO2以及生长产生的小分子有机物等可以作为碳源促进小球藻的生长，因而可以很好的平衡培养过程中溶解氧以及pH变化的影响，能使共培养体系在一定时间内维持在相对稳定的环境中。
3、小球藻和酵母共培养也显著提高了酵母废水的净化效果，不仅能够在一定程度上去除酵母废水中的COD、BOD、氮、磷、重金属等污染物，酵母废水中COD、NH3-N、TN、TP、PO43-和BOD的总去除率可分别高达80.98%、78.54%、83.21%、100%、100%和87.76%;而且可以节约淡水资源，大大降低生产成本，同时还能收获具有综合利用价值的小球藻和酵母生物量。可见，本发明是减少环境污染、实现酵母废水资源化利用的有效途径。