申请日2017.04.19
公开(公告)日2017.08.18
IPC分类号C12N1/36; C12N1/20; C02F3/34; C02F101/34
摘要
本发明属于环境微生物技术领域，涉及到菌株的复壮，特别涉及到一种处理双酚类含氮污水的异养硝化好氧反硝化菌的复壮方法。采用含普通碳源的培养基进行培养，逐渐加入双酚类含氮配水并提高其配比，使得微生物经过一个循序渐进的驯化过程并逐渐恢复其对双酚类污染物的适应能力，最后得到以双酚类污染物为碳源的异养硝化好氧反硝化菌株。该方法相对于直接用含普通碳源的培养基或双酚类含氮配水反复培养进行复壮的方法，复壮的成功率更高，而且该方法在操作上简单易行，耗时较少。并且利用双酚类污染物的降解情况、氨氮去除率及其转化为气态氮的转化率等作为评价复壮菌株性能的指标，比较全面。
权利要求书
1.一种降解双酚类含氮污水的异养硝化好氧反硝化菌的复壮方法，其特征在于，步骤如下：
(1)对需要复壮的菌种进行驯化培养：
(1.1)配制液体培养基I，各种物质的浓度配比为：(NH4)2SO4 0.1-0.5g/L、柠檬酸钠1-3g/L、乙酸钠1-3g/L、K2HPO4·2H2O 5-6g/L、KH2PO4 2-3g/L、MgSO4·7H2O 0.2-0.8g/L、CaCl20.02-0.1g/L，pH调节至6.8-7.2;
(1.2)配制双酚类含氮配水，各种物质的浓度配比为：(NH4)2SO4 0.01-0.02g/L、双酚类物质0.2-0.5g/L、K2HPO4·2H2O 5-6g/L、KH2PO4 2-3g/L、MgSO4·7H2O 0.2-0.8g/L、CaCl20.02-0.1g/L，pH调节至6.8-7.2;
将配制的液体培养基I和双酚类含氮配水进行灭菌处理;
(1.3)在无菌条件下配制三类液体培养基：
第一类为100%体积的液体培养基I;
第二类包括多个液体培养基，每个由不同体积比例的液体培养基I和双酚类含氮配水配成，并且液体培养基I所占的体积比例按递减的顺序配制，液体培养基I的体积比例范围为90%～10%;双酚类含氮配水所占的体积比例按递增的顺序配制，双酚类含氮配水的体积比例范围为10%～90%;
第三类为100%体积的双酚类含氮配水;
将配好的三类液体培养基进行灭菌处理;
(1.4)将需要复壮的异养硝化好氧反硝化菌种进行逐步驯化培养，首先使用第一类液体培养基，驯化培养1-2d;再更换到第二类液体培养基中，从双酚类含氮配水占第二类液体培养基的体积的10%开始，逐渐增加双酚类含氮配水的体积比例，直到双酚类含氮配水占第二类液体培养基的体积的90%，每增加一次，驯化培养1-2d;最后更换第三类液体培养基，驯化培养1-2d;
驯化培养的具体步骤：在无菌条件下，首先用磷酸盐缓冲液将需要复壮的异养硝化好氧反硝化菌种清洗并离心2-3次，去掉上清液;接着加入磷酸盐缓冲液进行震荡重悬，得到均匀菌液，移取菌液接种至步骤(1.3)配制的液体培养基中，使得初始菌种的浓度为OD600=0.1-0.15，最后将液体培养基置于无菌、30-35℃、100-150rpm的条件下进行驯化培养;其中，磷酸盐缓冲液中各物质的浓度配比为：K2HPO4·2H2O 5-6g/L、KH2PO4 2-3g/L，将磷酸盐缓冲液pH调节至6.8-7.2;离心条件为：8000-10000×g、5min、4℃;OD600为在600nm波长下测得的异养硝化好氧反硝化菌菌浓度;
(2)对驯化培养后的细菌进行分离纯化：
配制固体培养基，各种物质的浓度配比为：(NH4)2SO4 0.1-0.5g/L、柠檬酸钠1-3g/L、乙酸钠1-3g/L、K2HPO4·2H2O 5-6g/L、KH2PO4 2-3g/L、MgSO4·7H2O 0.2-0.8g/L、CaCl2 0.02-0.1g/L、琼脂20g/L，pH调节至6.8-7.2;
用平板划线法将驯化培养后的异养硝化好氧反硝化菌接种至灭菌固体培养基，将平板倒置于30-35℃恒温培养箱中培养2-3d以得到单一菌落;
(3)对有效菌种进行初筛：
A.挑取平板中的单一菌落分别接种至第一类液体培养基中，将接种后的第一类液体培养基置于30-35℃、100-150rpm条件下恒温震荡培养1-2d，取样测定氨氮及总氮去除率;
B.对测定的氨氮及总氮去除率水平达到菌种正常去除水平80%以上的菌株，以OD600为0.1-0.15的接种量分别接种至第三类液体培养基中，将接种后的第三类液体培养基置于30-35℃、100-150rpm条件下恒温震荡培养2-3d，取样测定双酚类污染物、氨氮及总氮去除率;
重复步骤B，直到测定的双酚类污染物、氨氮及总氮去除达到退化前正常去除水平并保持稳定;
(4)对有效菌种进行氮平衡分析：将步骤(3)中得到的菌株以OD600为0.1-0.15的接种量接种至双酚类含氮配水中，并接入氧气和氦气体积比3：7组成的混合气进行曝气，待曝气10-20min之后将反应体系进行密封处理，于30-35℃培养箱中静止培养2-3d;产生的气体用气相色谱法测定，得到N2和N2O的浓度;测定液体部分总氮、氨氮、硝态氮及亚硝态氮的浓度，用冷冻干燥法处理菌体部分，测定菌体细胞内有机氮的浓度，通过对氮素的定量计算确定菌株对氨氮的代谢特性，得到高效降解双酚类含氮污水的异养硝化好氧反硝化菌株。
说明书
一种降解双酚类含氮污水的异养硝化好氧反硝化菌的复壮方法
技术领域
本发明属于环境微生物领域，涉及到菌株的复壮，特别涉及到一种处理双酚类含氮污水的异养硝化好氧反硝化菌的复壮方法。
背景技术
传统的氨氮污水处理需要经过自养的硝化作用和异养的反硝化作用两个阶段才能完成。由于自养硝化细菌的增殖速度慢导致硝化效率较低，从而大大增加了处理过程的耗时，整个污水处理过程脱氮效果的稳定性也容易受到影响。而且硝化和反硝化阶段需要分开进行增加了能耗，同时占地面积较大、投资和运行成本较大。
异养硝化好氧反硝化细菌的发现和应用在很大程度上解决了上述问题，使得好氧条件下硝化和反硝化在同一个反应器中进行成为可能。污水中有机污染物存在较多时，异养型细菌由于利用有机物增殖速率较快，从而容易成为优势菌种，特别是很多异养硝化好氧反硝化细菌能够利用难降解有机物为碳源，这对于污水中有机物特别是难降解有机物去除和脱氮有着重要意义。
通常异养硝化好氧反硝化菌经过一定时间的高效运行，由于反复迭代而出现特定活性退化，或由于菌种保藏不当而出现功能降低现象，需要对其进行复壮，以维持其脱氮性能的稳定性。现有的菌种复壮技术一般利用菌种培养基进行反复培养的方法，但是通常复壮效果欠佳并且耗时较长。因此提出异养硝化好氧反硝化菌的高效复壮方法具有重要意义。本发明提供了一种复壮效果好、快速并且简单易行的异养硝化好氧反硝化菌的复壮方法。
发明内容
针对现有复壮技术中存在的不足，本发明的目的在于提供一种降解双酚类含氮污水 的异养硝化好氧反硝化菌的复壮方法，以为双酚类含氮污水的处理提供持续的微生物源。
本发明的技术方案：
一种降解双酚类含氮污水的异养硝化好氧反硝化菌的复壮方法，步骤如下：
(1)对需要复壮的菌种进行驯化培养：
(1.1)配制液体培养基I，各种物质的浓度配比为：(NH4)2SO4 0.1-0.5g/L、柠檬酸钠1-3g/L、乙酸钠1-3g/L、K2HPO4·2H2O 5-6g/L、KH2PO4 2-3g/L、MgSO4·7H2O 0.2-0.8g/L、CaCl2 0.02-0.1g/L，pH调节至6.8-7.2;
(1.2)配制双酚类含氮配水，各种物质的浓度配比为：(NH4)2SO4 0.01-0.02g/L、双酚类物质0.2-0.5g/L、K2HPO4·2H2O 5-6g/L、KH2PO4 2-3g/L、MgSO4·7H2O0.2-0.8g/L、CaCl20.02-0.1g/L，pH调节至6.8-7.2;
将配制的液体培养基I和双酚类含氮配水进行灭菌处理;
(1.3)在无菌条件下配制三类液体培养基：
第一类为100%体积的液体培养基I;
第二类包括多个液体培养基，每个由不同体积比例的液体培养基I和双酚类含氮配水配成，并且液体培养基I所占的体积比例按递减的顺序配制，液体培养基I的体积比例范围为90%～10%;双酚类含氮配水所占的体积比例按递增的顺序配制，双酚类含氮配水的体积比例范围为10%～90%;
第三类为100%体积的双酚类含氮配水;
将配好的三类液体培养基进行灭菌处理;
(1.4)将需要复壮的菌种进行逐步驯化培养，首先使用第一类液体培养基，驯化培养1-2d;再按所配液体培养基中双酚类含氮配水所占的体积比例递增的顺序更换第二类液体培养基，每更换一次驯化培养1-2d;最后更换第三类液体培养基，驯化培养1-2d;
驯化培养的具体步骤为：在无菌条件下，首先用磷酸盐缓冲液将需要复壮的异养硝化好氧反硝化菌种清洗并离心2-3次，去掉上清液，接着加入磷酸盐缓冲液进行震荡重悬，得到均匀菌液，移取菌液接种至步骤(1.3)配制的液体培养基中，使得初始菌种的浓度为OD600=0.1-0.15，最后将液体培养基置于无菌、30-35℃、100-150rpm的条件下进行驯化培养;其中，磷酸盐缓冲液中各物质的浓度配比为：K2HPO4·2H2O 5-6g/L、KH2PO4 2-3g/L，将磷酸盐缓冲液pH调节至6.8-7.2;离心条件为：8000-10000×g、5min、4℃;OD600为在600nm波长下测得的细菌浓度;
(2)对驯化培养后的细菌进行分离纯化：
配制固体培养基，各种物质的浓度配比为：(NH4)2SO4 0.1-0.5g/L、柠檬酸钠1-3g/L、乙酸钠1-3g/L、K2HPO4·2H2O 5-6g/L、KH2PO4 2-3g/L、MgSO4·7H2O0.2-0.8g/L、CaCl20.02-0.1g/L、琼脂20g/L，pH调节至6.8-7.2;
用平板划线法将驯化培养后的细菌接种至灭菌固体培养基，将平板倒置于30-35℃恒温培养箱中培养2-3d以得到单一菌落;
(3)对有效菌种进行初筛：
A.挑取平板中的单一菌落分别接种至第一类液体培养基中，将接种后的第一类液体培养基置于30-35℃、100-150rpm条件下恒温震荡培养1-2d，取样测定氨氮及总氮去除率;
B.对测定的氨氮及总氮去除水平达到菌种正常去除水平80%以上的菌株，以OD600为0.1-0.15的接种量分别接种至第三类液体培养基中，将接种后的第三类液体培养基置于30-35℃、100-150rpm条件下恒温震荡培养2-3d，取样测定双酚类污染物、氨氮及总氮去除率;
重复步骤B，直到测定的双酚类污染物、氨氮及总氮去除达到退化前正常去除水平并保持稳定。
(4)对有效菌种进行氮平衡分析。将步骤(3)中得到的菌株以OD600为0.1-0.15的接种量接种至双酚类含氮配水中，并接入由氧气和氦气组成的混合气(体积比3/7)进行曝气，待曝气10-20min之后将反应体系进行密封处理，于30-35℃培养箱中静止培养2-3d。产生的气体用气相色谱法(GC)测定，得到N2和N2O的浓度;测定液体部分总氮、氨氮、硝态氮及亚硝态氮的浓度，用冷冻干燥法处理菌体部分，测定菌体细胞内有机氮的浓度，通过对氮素的定量计算确定菌株对氨氮的代谢特性，得到高效降解双酚类含氮污水的异养硝化好氧反硝化菌株。
本发明的效果和益处：本发明提供了一种高效、简单易行的异养硝化好氧反硝化菌的复壮方法。采用含普通碳源的培养基进行培养，逐渐加入双酚类含氮配水并提高其配比，使得微生物经过一个循序渐进的驯化过程并逐渐恢复其对双酚类污染物的适应能力，最后得到以双酚类污染物为碳源的异养硝化好氧反硝化菌株。该方法相对于直接用含普通碳源的培养基或双酚类含氮配水反复培养进行复壮的方法，复壮的成功率更高，而且在操作上简单易行，耗时较少。并且利用双酚类污染物的降解情况、氨氮去除率及其转化为气态氮的转化率等作为评价复壮菌株性能的指标，比较全面。
具体实施方式
正常的HS-2菌种是具有高效降解双酚F含氮配水功能的异养硝化好氧反硝化细菌，本实施方式对功能已发生退化的HS-2菌株进行复壮，步骤如下：
(1)对需要复壮的HS-2菌种进行驯化培养：
(1.1)配制液体培养基I，各种物质的浓度配比为：(NH4)2SO4 0.3g/L、柠檬酸钠2g/L、乙酸钠2g/L、K2HPO4·2H2O 5.5g/L、KH2PO4 2.6g/L、MgSO4·7H2O0.2g/L、CaCl2 0.02g/L，pH调节至7.0;
(1.2)配制双酚F含氮配水，各种物质的浓度配比为：(NH4)2SO4 0.012g/L、双酚F0.3g/L、K2HPO4·2H2O 5.5g/L、KH2PO4 2.6g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、CaCl20.02g/L，pH调节至7.0;
将配制的液体培养基I和双酚F含氮配水进行灭菌处理;
(1.3)在无菌条件下配制三类液体培养基：
第一类为100%体积的液体培养基I;
第二类包括多个液体培养基，每个由不同体积比例的液体培养基I和双酚F含氮配水配成，并且液体培养基I所占的体积比例按递减的顺序配制，液体培养基I的体积比例范围为80%、60%、40%、20%;双酚F含氮配水所占的体积比例按递增的顺序配制，双酚F含氮配水的体积比例范围为20%、40%、60%、80%;
第三类为100%体积的双酚F含氮配水;
将配好的三类液体培养基进行灭菌处理;
(1.4)将需要复壮的菌种进行逐步驯化培养，首先使用第一类液体培养基，驯化培养1d;再按80%体积的液体培养基I与20%体积的灭菌双酚F含氮配水组成的培养基、60%体积的液体培养基I与40%体积的灭菌双酚F含氮配水组成的培养基、40%体积的液体培养基I与60%体积的灭菌双酚F含氮配水组成的培养基、20%体积的液体培养基I与80%体积的灭菌双酚F含氮配水组成的培养基的顺序更换第二类液体培养基，每更换一次驯化培养1d;最后更换第三类液体培养基，驯化培养1d;
驯化培养的具体步骤为：在无菌条件下，首先用磷酸盐缓冲液将需要复壮的异养硝化好氧反硝化菌种清洗并离心2次，去掉上清液，接着加入磷酸盐缓冲液进行震荡重悬，得到均匀菌液，移取菌液接种至步骤(1.3)配制的液体培养基中，使得初始菌种的浓度为OD600=0.1，最后将液体培养基置于无菌、35℃、150rpm的条件下进行驯化培养;其中，磷酸盐缓冲液中各物质的浓度配比为：K2HPO4·2H2O 5.5g/L、KH2PO4 2.6g/L，将磷酸盐缓冲液pH调节至7.0;离心条件为：10000×g、5min、4℃;OD600为在600nm波长下测得的细菌浓度;
(2)对驯化培养后的细菌进行分离纯化：
配制固体培养基，各种物质的浓度配比为：(NH4)2SO4 0.3g/L、柠檬酸钠2g/L、乙酸钠2g/L、K2HPO4·2H2O 5.5g/L、KH2PO4 2.6g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、CaCl20.02g/L、琼脂20g/L，pH调节至7.0;
用平板划线法将驯化培养后的细菌接种至灭菌固体培养基，将平板倒置于35℃恒温培养箱中培养2d以得到单一菌落;
(3)对有效菌种进行初筛：
A.挑取平板中的HAW1-12共12个单菌落分别接种至第一类液体培养基中，将接种后的第一类液体培养基置于35℃、150rpm条件下恒温震荡培养1d，取样测定氨氮及总氮去除率;
B.对测定的氨氮及总氮去除水平达到菌种正常去除水平80%以上的菌株HAW2-4、HAW6、HAW8-10，以OD600为0.1的接种量分别接种至第三类液体培养基中，将接种后的第三类液体培养基置于35℃、150rpm条件下恒温震荡培养2d，取样测定双酚F、氨氮及总氮去除率;
重复步骤B，直到筛选出双酚F、氨氮及总氮去除率分别达到99%、96%及90%并保持稳定的两个菌株HAW3、HAW6。
(4)对有效菌种进行氮平衡分析。将步骤(3)中得到的菌株HAW3和HAW6分别以OD600为0.1的接种量接种至双酚F含氮配水中，并接入由氧气和氦气组成的混合气(体积比3/7)进行曝气，待曝气10min之后将反应体系进行密封处理，于35℃培养箱中静止培养2d。产生的气体用气相色谱法(GC)测定，得到N2和N2O的浓度;测定液体部分总氮、氨氮、硝态氮及亚硝态氮的浓度，用冷冻干燥法处理菌体部分，测定菌体细胞内有机氮的浓度，通过对氮素的定量计算确定菌株对氨氮的代谢特性，得到的菌株HAW6能够将47%以上的初始氨氮转化为N2，与退化之前的正常菌株功能相同。