申请日2017.06.22
公开(公告)日2017.10.20
IPC分类号C02F3/34; C02F101/16
摘要
本发明公开了一种利用群体感应调控铜绿假单胞菌好氧反硝化以去除废水中硝酸盐的方法，包括如下步骤：将对数期的野生型铜绿假单胞菌种子液接种至含硝酸盐的废水或含硝酸盐的人工模拟废水中，然后向废水或人工模拟废水中投加群体感应淬灭剂以降低信号分子的浓度或使信号分子失活，使其无法发挥正常作用。或者将铜绿假单胞菌突变株ΔlasI、铜绿假单胞菌突变株ΔrhlI或铜绿假单胞菌突变株ΔlasIΔrhlI培养至处于对数期，得种子液，然后将处于对数期的种子液接种至含硝酸盐的工业废水或含硝酸盐的人工模拟废水中。本发明运用群体感应调控机制，调控方便，能够较大程度提高铜绿假单胞菌脱氮能力，降低脱氮成本，具有比较明显的优势。
权利要求书
1.一种利用群体感应调控铜绿假单胞菌好氧反硝化以去除废水中硝酸盐的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将处于对数期的野生型铜绿假单胞菌种子液接种至含硝酸盐的废水或含硝酸盐的人工模拟废水中，然后向废水或人工模拟废水中投加群体感应淬灭剂，将信号分子3OC12和信号分子C4淬灭至发挥作用的阈值以下。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述工业废水或人工模拟废水中以N计硝氮含量为180-200mg/L。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，采用人工模拟废水，所述人工模拟废水由如下方法配置：
取KH2PO4溶液，Na2HPO4、Concentrated base与蒸馏水混合，经高压灭菌、冷却后加入NaNO3和Protein Hydrolysate Amicase，混匀后过滤即得所述人工模拟废水;
所述人工模拟废水中KH2PO4摩尔浓度为0.01M～0.015M，Na2HPO4摩尔浓度为0.01M～0.015、Concentrated base体积百分比为0.5～1.5%、NaNO3摩尔浓度为0.005M～0.015M、Protein Hydrolysate Amicase浓度为0.002g/mL～0.008g/mL。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述人工模拟废水中KH2PO4摩尔浓度为0.0125M，Na2HPO4摩尔浓度为0.0125M、CB体积百分比为1%、NaNO3摩尔浓度为0.01M、Protein Hydrolysate Amicase浓度为0.005g/mL。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述群体感应淬灭剂为酰基高丝氨酸内酯酶。
6.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述群体感应淬灭剂的投加量为15mg/L～25mg/L。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，信号分子3OC12发挥作用的阈值为2uM，信号分子C4发挥作用的阈值为10uM。
8.一种利用群体感应调控铜绿假单胞菌好氧反硝化以去除废水中硝酸盐的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将野生型铜绿假单胞菌的lasI基因和IrhlI基因的至少一个敲出，得lasI基因缺失的铜绿假单胞菌突变株ΔlasI、IrhlI基因缺失的铜绿假单胞菌突变株ΔrhlI或lasI基因与IrhlI基因双缺失的铜绿假单胞菌突变株ΔlasIΔrhlI;
(2)将所得铜绿假单胞菌突变株ΔlasI、铜绿假单胞菌突变株ΔrhlI或铜绿假单胞菌突变8株ΔlasIΔrhlI培养至对数期，得种子液，然后将处于对数期的种子液接种至含硝酸盐的工业废水或含硝酸盐的人工模拟废水中。
9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述工业废水或人工模拟废水中以N计硝态氮浓度为180-200mg/L。
10.根据权利要求8所述方法，其特征在于，采用人工模拟废水，所述人工模拟废水由如下方法配置：
取KH2PO4溶液，Na2HPO4、Concentrated base与蒸馏水混合，经高压灭菌、冷却后加入NaNO3和Protein Hydrolysate Amicase，混匀后过滤即得所述人工模拟废水;
所述人工模拟废水中KH2PO4摩尔浓度为0.01M～0.015M，Na2HPO4摩尔浓度为0.01M～0.015、CB体积百分比为0.5～1.5%、NaNO3摩尔浓度为0.005M～0.015M、ProteinHydrolysate Amicase浓度为0.002g/mL～0.008g/mL。
说明书
利用群体感应调控铜绿假单胞菌好氧反硝化以除废水中硝酸盐的方法
技术领域
本发明属于污水处理技术领域，具体涉及两种群体感应系统及群体感应淬灭剂调控铜绿假单胞菌好氧反硝化去除废水中硝酸盐的方法。
背景技术
近年来，随着农业的快速发展和工业化进程的加快，污水排放量逐年增加，其中含硝酸盐废水排放量占据着重要的比重。含硝酸盐废水的大量排放对人体、水生生物和水体具有一定的危害作用。目前含硝酸盐废水的处理方法主要有物理化学法(Matos CT et al，Journal of Hazardous Materials，2009，166(1):428-434.)催化法(Yi Wang，et al，Applied Catalysis A General，2009，361(1/2):123-129.)和生物法(Pahacova P，et al，Bioresource Tehnology，2010，101(1):150-156.)。
其中，生物法脱氮应用较为广泛的是厌氧反硝化法，厌氧反硝化主要是利用反硝化细菌在缺氧/厌氧状态下，以硝酸盐作为电子受体，将硝态氮变为氮气的过程。但是该方法工艺复杂、运行管理要求高、反应速率缓慢、反应器体积大且需要有机营养物质来维持反硝化细菌的菌体浓度和正常代谢。
与厌氧反硝化菌相比，好氧反硝化菌活性高，无需进行厌氧好氧周期控制，在废水生物处理技术中极具应用潜力。从上个世纪80年代一株好氧反硝化菌被筛选分离后，好氧反硝化技术得到广泛的研究，并取得了一定的发展。相关研究者发展并完善了细菌好氧反硝化过程中电子传递模型，该模型指出电子既可以传递给硝酸盐也可以传递给氧气，氧气得电子能力阻止电子传递给硝酸盐或亚硝酸盐从而抑制好氧反硝化的观点是错误的，即好氧反硝化是存在的(图1为细菌好氧反硝化电子传递模型)。铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PAO1)是一类典型的兼性反硝化菌，既可以在无氧条件下进行反硝化作用，也可以在好氧条件下进行反硝化作用。
细菌的群体感应(Quorum sensing，QS)广泛存在于微生物中，是一个依赖菌群密度的基因调控系统(Miller M B，et al.Annual Review of Microbiology，2001，55(1):165-199.)。细菌繁殖过程中会分泌一些信号分子，信号分子的浓度随着菌群密度的增大而增加，细菌通过感知这些信号分子来检测其生存环境中自身或者其他细菌的数量变化，当信号分子的浓度到达阈值后，就会与特定的转录调节子相结合，从而调控一种或多种基因的表达来适应生存环境的变化。铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PAO1)至少拥有3套完整的群体感应系统，它们分别是受酰基高丝氨酸内酯类信号分子调节的las系统、rhl系统以及喹诺酮类(AHQ) 系统。Las、Rhl系统分别由信号分子合成酶lasI、rhlI和转录激活因子lasR 和rhlR组成;Las、Rhl系统信号分子分别是N-(3-oxododecanoyl)-HSL (3OC12-HSL)N-butyryl-HSL(C4-HSL)(de Kievit T R，et al，Infection and Immunity 2000，68(9):4839-4849.)。PAO1作为一种典型的兼性反硝化菌，在其好氧反硝化阶段随着菌株菌群密度的增加，群体感应信号分子3OC12 和C4的密度可能具有一定的变化，当信号分子的浓度达到某一阈值时，反硝化基因的表达可能会受到一定的影响，从而影响铜绿假单胞菌的好氧反硝化行为。
群体感应淬灭(quorum quenching，QQ)是指对细菌的群体感应调控机制进行干扰和破坏的行为。群体感应淬灭酶主要有内酯酶 (AHL-lactnase)和酰基转移酶(AHL-acylase)两大类，内酯酶可以水解 AHL的内酯键，生成的酰基高丝氨酸的生物活性大大降低。酰基转移酶则作用于连在酰基高丝氨酸内酯上的氨基，生成脂肪酸和不具有任何生物活性的高丝氨酸内酯。群体感应淬灭酶可以快速、高效地降解信号分子，从而间接影响相关基因的表达以及相关的生物行为。
发明内容
本发明提供了一种通过强化铜绿假单胞菌好氧反硝化能力从而降低污水含氮量的方法。运用群体感应调控机制，调控方便，能够较大程度提高铜绿假单胞菌脱氮能力，降低脱氮成本，具有比较明显的优势。
一种利用群体感应调控铜绿假单胞菌好氧反硝化的方法，包括如下步骤：
将对数期的野生型铜绿假单胞菌种子液接种至含硝酸盐的工业废水或含硝态氮的人工模拟废水中，然后向工业废水或人工模拟废水中投加群体感应淬灭剂，以淬灭群体感应信号分子，将其浓度淬灭至一定的阈值，所述信号分子为3OC12和C4。
本发明还提供另一种利用群体感应调控铜绿假单胞菌好氧反硝化以去除废水中硝酸盐的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将野生型铜绿假单胞菌的lasI基因和IrhlI基因的至少一个敲出，得lasI基因缺失的铜绿假单胞菌突变株ΔlasI、IrhlI基因缺失的铜绿假单胞菌突变株ΔrhlI或lasI基因与IrhlI基因双缺失的铜绿假单胞菌突变株ΔlasIΔrhlI;
(2)将所得铜绿假单胞菌突变株ΔlasI、铜绿假单胞菌突变株ΔrhlI 或铜绿假单胞菌突变株ΔlasIΔrhlI培养至处于对数期，得种子液，然后将处于对数期的种子液接种至含硝酸盐的工业废水或含硝酸盐的人工模拟废水中。
优选地，所述工业废水或人工模拟废水中以N计硝氮含量为180-200 mg/L。
进一步，采用人工模拟废水，所述人工模拟废水由如下方法配置：
取KH2PO4溶液，Na2HPO4、Concentrated base(CB)与蒸馏水混合，经高压灭菌、冷却后加入NaNO3和Protein Hydrolysate Amicase，混匀后过滤即得所述人工模拟废水;
所述人工模拟废水中KH2PO4摩尔浓度为0.01M～0.015M，Na2HPO4摩尔浓度为0.01M～0.015、CB体积百分比为0.5～1.5%、NaNO3摩尔浓度为0.005M～0.015M、ProteinHydrolysate Amicase浓度为0.002g/mL～0.008 g/mL。
更进一步地，所述人工模拟废水中KH2PO4摩尔浓度为0.0125M， Na2HPO4摩尔浓度为0.0125M、CB体积百分比为1%、NaNO3摩尔浓度为 0.01M、Protein Hydrolysate Amicase浓度为0.005g/mL。
进一步地，具体操作步骤为：取0.5M KH2PO4 7.5mL，0.5M Na2HPO4 7.5mL，CB 3mL，279mL蒸馏水于500mL的蓝口瓶中，高压灭菌30min;②待上述液体冷却后，加入3mL 1MNaNO3和1.5g Protein Hydrolysate Amicase，混匀后，用一次性系统进行过滤、保存。
CB为镁盐、钙盐、钼盐和亚铁盐的混合溶液，每种盐的浓度根据实际需要可自行调整，本发明的CB混合溶液中，优选地，镁盐、钙盐、钼盐和亚铁盐的浓度分别为28～29g/L、5～5.5g/L、0.01～0.05g/L和 0.1～0.2g/L;最优选地，镁盐、钙盐、钼盐和亚铁盐的浓度分别为28.9g/L、 5.0365g/L、0.0185g/L和0.198g/L。
进一步地，混合溶液中还含有体积比1%的Metal 44。
以最优选浓度为例，本发明中所采用CB由如下方法配置：
1LCB：加20g氨三乙酸入600mL蒸馏水中，再加入14.6gKOH，溶解后按以下顺序加入各金属盐：28.9g MgSO4、5.0365g无水Cacl2、0.0185g (NH4)6Mo7O24·4H2O、0.198gFeSO4·7H2O，100mL Metal 44(Metal44的配置方法如下)，调节pH为6.8，定容至1L。
1L Metal44:取800mL水加入2.5g EDTA搅拌(加入转子)，然后用 10M的NaOH调节pH到5.0使其溶解。按顺序加入各金属盐：10.95g ZnSO4·7H2O、5g FeSO4·7H2O、1.54gMnSO4·H2O、0.392g CuSO4·5H2O、 0.25g Co(NO3)2·6H2O、0.177gNa2B4O7·10H2O。在之前的完全溶解后再加入下个金属盐，补足到1L，一次性过滤系统过滤后置于4℃保存。
本发明采用模拟人工废水，且采用纯菌培养，为了保证不染菌且为好氧状态，选择带有透气塞的容器进行反应，例如在可容纳25-30mL的试管中加6mL人工模拟废水，用透气的塞子堵住试管口即可。由于实验中的转速较大，试管体积较大、溶液较少，因此在实验过程中溶液可以充分地和氧气接触，不会出现出现底部缺氧、气液接触面好氧的状况。
优选地，所述群体感应淬灭剂为酰基高丝氨酸内酯酶。
进一步优选地，所述群体感应淬灭剂的投加量为15mg/L～25mg/L。
优选地，信号分子3OC12发挥作用的阈值为2uM，信号分子C4发挥作用的阈值为10uM。
投加群体感应淬灭剂后对废水进行搅拌或震荡;优选地，采用摇床培养，进一步优选地，所述摇床培养时摇床转速控制在250rpm～300rpm。
摇床培养的温度为37℃左右，培养时间为10～15小时，优选为12小时。
本发明所用的铜绿假单胞菌野生株采用常规方法进行分离即可。铜绿假单胞菌的突变菌株ΔlasI，ΔrhlI和ΔlasIΔrhlI的构建方法已在(Jianming Zeng，etal.Scientific Reports，2016，1-10.)公开。本发明中突变菌株的构建步骤按照该文献公开的方法，采用现有的分子生物学技术进行。
本发明对进行好氧反硝化的单菌落活化时间进行了优化，活化时间优选为12h，优先选用处于对数生长期或稳定期前期的种子液，更优先选用处于对数生长期的种子液。
调控原理如下：本发明通过研究发现，酰基高丝氨酸内酯类群体感应信号分子3OC12-HSL和C4-HSL的存在会抑制铜绿假单胞菌的好氧反硝化能力，信号分子3OC12-HSL由铜绿假单胞菌的lasI基因编码，信号分子C4-HSL由铜绿假单胞菌的rhlI基因编码，本发明通过添加合适的信号分子淬灭剂将这两种信号分子淬灭或者直接通过基因手段将铜绿假单胞菌中的rhlI基因和rhlI基因敲除，解除信号分子3OC12-HSL和C4-HSL 对铜绿假单胞菌好氧反硝化能力的抑制，提高铜绿假单胞菌的好氧反硝化能力，降低废水中硝酸盐含量。
信号分子3OC12-HSL和C4-HSL的基本结构式为：
其中当信号分子为3OC12-HSL时，官能团R为：
当信号分子为C4-HSL时，官能团R为：
本发明的有益结果为：
本发明提出了利用群体感应信号分子AHLs调控铜绿假单胞菌好氧反硝化方法，从群体感应角度对PAO1好氧反硝化能力进行调控。该发明结果表明，铜绿假单胞菌野生株、外加信号分子3OC12-HSL或者C4-HSL 的铜绿假单胞菌突变菌株(ΔlasI，ΔrhlI和ΔlasIΔrhlI)对硝酸盐的去除能力低于未外加信号分子的铜绿假单胞菌突变株(ΔlasI，ΔrhlI和ΔlasIΔrhlI)(如图2)。反硝化中间产物亚硝酸盐在突变株中的累积量高于野生株及外加信号分子的突变株。
通过进一步研究发现，硝酸盐还原酶和亚硝酸盐还原酶在突变株中的活性高于在野生株和外加信号分子的突变株中的活性;硝酸盐酶活性与亚硝酸盐酶的活性进一步解释了突变株中亚硝酸盐累积量高于野生株和外加信号分子的突变株。酰基高丝氨酸内酯酶的添加对信号分子具有较好的降解性能，且酰基高丝氨酸内酯酶的加入可以提高菌株对硝酸盐的去除性能(如图3)。因而在处理含硝酸盐废水中，可以利用基因lasI或rhlI发生突变的铜绿假单胞菌或者通过外源添加群体感应淬灭酶来促进PAO1的脱氮性能。利用本发明处理含硝酸盐废水不仅可以提高硝酸盐去除率，还可以降低反应成本，具有重要的理论价值和意义。