申请日2019.04.07
公开(公告)日2019.07.12
IPC分类号C02F9/14
摘要
本发明涉及一种处理含脑膜脓毒性金黄杆菌的再生水的方法，属于水处理领域。在含脑膜脓毒性金黄杆菌的再生水中加入生物絮凝剂溶液，加入103个/L致死质粒供体菌，并加入浓度为50‑80mg/L纳米级氧化石墨烯，24小时后达到对脑膜脓毒性金黄杆菌致死率大于50%，36小时以后的致死率可达80%以上。优点是：所用来源于枯草芽孢杆菌所分泌的生物絮凝剂高效絮凝脑膜脓毒性金黄杆菌及相关菌群，从而实现促菌群细胞絮凝聚合，另外通过低浓度氧化石墨烯提脑膜脓毒性金黄杆菌接合生殖过程中pNJR6质粒在菌群内部传播效率，从而实现先絮凝去除在诱导杀死以降低脑膜脓毒性金黄杆菌在再生水中的感染风险的目的。
权利要求书
1.一种处理含脑膜脓毒性金黄杆菌的再生水的方法，其特征在于，包括下列步骤：
(a)在含脑膜脓毒性金黄杆菌的再生水中加入生物絮凝剂溶液，搅拌均匀，所述含脑膜脓毒性金黄杆菌的再生水与生物絮凝剂溶液的体积比为90：(5-10)，该生物絮凝剂溶液的浓度为3-5g/ml;
(b)利用热激转化法或电转化法将pNJR6质粒转化进入大肠杆菌细胞，最低转化率为10%，作为致死质粒供体菌;
(c)向步骤(a)加入了生物絮凝剂溶液的脑膜脓毒性金黄杆菌的再生水中加入103个/L致死质粒供体菌，并加入浓度为50-80mg/L纳米级氧化石墨烯，24小时后达到对脑膜脓毒性金黄杆菌致死率大于50%，36小时以后的致死率可达80%以上;
(d)60小时后向步骤(c)的再生水中加入浓度为3-5g/ml生物絮凝剂溶液，体积比为90：10，去除细胞裂解产生的蛋白质核酸和细胞内溶物。
2.根据权利要求1所述的处理含脑膜脓毒性金黄杆菌的再生水的方法，其特征在于：所述步骤(a)中生物絮凝剂的制备步骤如下：
(1)将枯草芽孢杆菌经发酵培养得到发酵液，发酵培养基包括：葡萄糖20gl-1，牛肉膏3.0gl-1，NaN03 2gl-1，KCl0.5gl-1，K2HP04 1gl-1，MgS04·7H20 0.5gl-1，FeS04 0.01gl-1，pH6.5-7.5，121℃，0.1MPa灭菌30min;接种量计为0.5-2g湿重菌丝/100ml，培养温度为20-35℃，振荡培养，时间为40-120小时，离心除去菌丝体，得到上清液;
(2)将上清液加2倍体积乙醇于4℃条件下过夜，次日混合液离心后，将得到的沉淀溶解于100ml的去离子水，同时加入50ml的2%的氯化十六烷吡啶，震荡3小时，之后，收集沉淀并溶解于100ml的0.5M的NaCl溶液，再加2倍体积的乙醇，离心并收集沉淀，离心力为6000g/min;
(3)将收集的沉淀用乙醇洗脱,并溶于5ml的去离子水，真空干燥，得生物絮凝剂。
3.根据权利要求2所述的处理含脑膜脓毒性金黄杆菌的再生水的方法，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌，其16SrDNA序列如SEQ ID No.1所述。
4.根据权利要求2所述的处理含脑膜脓毒性金黄杆菌的再生水的方法，其特征在于：步骤(1)中发酵培养pH7.0，培养温度为25-30℃，培养时间为80-100小时。
5.根据权利要求1所述的处理含脑膜脓毒性金黄杆菌的再生水的方法，其特征在于：步骤(c)中pH值为7。
6.根据权利要求1所述的处理含脑膜脓毒性金黄杆菌的再生水的方法，其特征在于：步骤(c)中纳米级氧化石墨烯的浓度为80mg/L。
说明书
一种处理含脑膜脓毒性金黄杆菌的再生水的方法
技术领域
本发明属于水处理领域，尤其涉及一种抑制水中脑膜脓毒性金黄杆菌感染风险的方法。
背景技术
再生水是污水经处理后的再利用，是国际公认的“第二水源”。在城市再生水的利用中，再生水主要是指城市污水或生活污水经处理后达到一定的水质标准，可在一定范围内重复使用的非饮用水。据有关资料统计，城市供水的80%转化为污水，经收集处理后，其中70%的再生水可以再次循环使用。这意味着通过污水回用，可以在现有供水量不变的情况下，使城市的可用水量至少增加50%以上。世界各国无不重视再生水利用，再生水作为一种合法的替代水源，正在得到越来越广泛的利用，并成为城市水资源的重要组成部分。但病原微生物的健康风险影响再生水可持续性的实现。传统活性污泥法的二次沉淀池出水经过滤和氯消毒后得到的再生水中，仍有一定数量的致病性病原菌、病毒、寄生性病原微生物的孢子存在。美国最新研究表明，再生水病原微生物的感染人数在近年来呈上升趋势。在传统氯消毒的基础上配合臭氧或加入紫外照射可以有效的使大部分孢子和孢囊灭活。但在再生水实际储存回用的过程中，病原微生物常以低活性状态存在，导致了病原微生物种群分布不均匀和感染致病剂量不稳定，掩盖了其侵袭活性并增加了其再爆发风险。脑膜脓毒性金黄杆菌(Chryseobacterium meningosepticum)是一种致命的细菌，尤其对婴幼儿和65岁以上老人等免疫系统较弱人群具有强烈的感染性和致命性。以美国威斯康辛州从2015年11月1日至2016年3 月2日，主要由再生水储存水库及淡水附近土壤所引发的脑膜脓毒性金黄杆菌 (Chryseobacterium meningosepticum)爆发事件为例，该区域共发生44例感染脑膜脓毒性金黄杆菌病例，其中18人死亡，并且在死亡人员的血液中发现了高浓度的感染细菌。而非致死性的人群也表现出包括发烧、呼吸急促、发冷或皮肤发红等病症。美国疾病控制与预防中心统计表明，此次爆发为历史上最大规模一次，同时该病菌感染效率有上升趋势。同时研究表明。脑膜脓毒性金黄杆菌(Chryseobacterium meningosepticum)具有一定嗜冷特性，同时部分携带抗药性质粒，证明其种群的抗药性和环境耐胁迫能力很强。
因而对再生水的储存回用中的脑膜脓毒性金黄杆菌(Chryseobacteriummeningosepticum)生物种群防控抑制成为再生水安全储存回用亟待解决的一个技术难题。已有研究表明利用传统化学絮凝剂例如：聚合氯化铝(PAC)、聚合氯化铁(PFC)、聚丙烯酰胺等被证实不仅对病原菌的絮凝效果很差，同时也使水体引入了金属离子和次级污染物质，能够造成二次污染，更加提高了再生水的使用成本。生物絮凝剂其主要成分为多糖、核酸及蛋白聚糖，因此具有应性强、安全性高、来源广泛的优点。另一方面，现代分子生物学技术的发展为再生水的安全储存和回用中病原微生物的种群抑制提供了新思路。外源质粒基因的细胞转化能调节微生物细胞的代谢水平，达到抑制病原微生物生长繁殖的目的，自杀质粒含有抑制元件，可以通过这些元件在细胞内的激活来控制含有自杀质粒的生物细胞的生命周期。自杀质粒作为主动抑制策略的基本条件是：通过质粒导入靶细胞内，使要被控制的微生物细胞内形成一种可控制的致死作用基因元件，这种基因元件在一般条件下不会干扰细胞的生活周期，但当一定的环境诱导因子或一些干扰信号出现时，这种致死作用基因元件被激活表达，从而达到结束细胞生命周期的目的。
发明内容
本发明提供一种处理含脑膜脓毒性金黄杆菌的再生水的方法，以解决再生水中存在的脑膜脓毒性金黄杆菌的种群爆发风险，对该菌群抑制不达标的问题。
本发明采取的技术方案是：包括下列步骤：
(a)在含脑膜脓毒性金黄杆菌的再生水中加入生物絮凝剂溶液，搅拌均匀，所述含脑膜脓毒性金黄杆菌的再生水与生物絮凝剂溶液的体积比为90：(5-10)，该生物絮凝剂溶液的浓度为3-5g/ml;
(b)利用热激转化法或电转化法将pNJR6质粒转化进入大肠杆菌细胞，最低转化率为10%，作为致死质粒供体菌;
(c)向步骤(a)加入了生物絮凝剂溶液的脑膜脓毒性金黄杆菌的再生水中加入103个/L致死质粒供体菌，并加入浓度为50-80mg/L纳米级氧化石墨烯，24小时后达到对脑膜脓毒性金黄杆菌致死率大于50%，36小时以后的致死率可达80%以上;
(d)60小时后向步骤(c)的再生水中加入浓度为3-5g/ml生物絮凝剂溶液，体积比为90：10，去除细胞裂解产生的蛋白质核酸和细胞内溶物。
本发明所述步骤(a)中生物絮凝剂的制备步骤如下：
(1)将枯草芽孢杆菌经发酵培养得到发酵液，发酵培养基包括：葡萄糖20gl-1，牛肉膏3.0gl-1，NaN03 2gl-1，KCl 0.5gl-1，K2HP04 1gl-1，MgS04·7H20 0.5gl-1，FeS04 0.01 gl-1，pH6.5-7.5，121℃，0.1MPa灭菌30min;接种量计为0.5-2g湿重菌丝/100ml，培养温度为20-35℃，振荡培养，时间为40-120小时，离心除去菌丝体，得到上清液;
(2)将上清液加2倍体积乙醇于4℃条件下过夜，次日混合液离心后，将得到的沉淀溶解于100ml的去离子水，同时加入50ml的2%的氯化十六烷吡啶，震荡3小时，之后，收集沉淀并溶解于100ml的0.5M的NaCl溶液，再加2倍体积的乙醇，离心并收集沉淀，离心力为6000g/min;
(3)将收集的沉淀用乙醇洗脱，并溶于5ml的去离子水，真空干燥，得生物絮凝剂。
本发明所述枯草芽孢杆菌，其16SrDNA序列如SEQ ID No.1所述。
本发明所述步骤(1)中发酵培养pH7.0，培养温度为25-30℃，培养时间为80-100小时。
本发明所述步骤(c)中pH值为7。
本发明所述步骤(c)中纳米级氧化石墨烯的浓度为80mg/L。
本发明的优点是：所用来源于枯草芽孢杆菌所分泌的生物絮凝剂高效絮凝脑膜脓毒性金黄杆菌及相关菌群，从而实现促菌群细胞絮凝聚合，另外通过低浓度氧化石墨烯提高脑膜脓毒性金黄杆菌接合生殖过程中pNJR6质粒在菌群内部传播效率。在生物絮凝剂和氧化石墨烯的双重作用下，利用构建的能够诱导脑膜脓毒性金黄杆菌细胞裂解的质粒pNJR6杀灭病原菌，从而实现先絮凝去除在诱导杀死以降低脑膜脓毒性金黄杆菌在再生水中的感染风险的目的。（发明人徐亮;孙彩云;孙大志;庄志军）