申请日2005.12.02
公开(公告)日2006.06.28
IPC分类号G01N33/18; C12N15/00; C12Q1/02; G01N15/00
摘要
本发明公开了一种制药废水的生殖毒性检测与评价方法，主要进程如下：以制药厂生产废水为测试废水，以小鼠为受试生物，通过经口灌胃对小鼠进行染毒;测试期满后观察小鼠精子形态、计算精子畸形率;测定各类生精细胞百分率，将染毒组数据与对照组进行差异显著性检验;用检验结果来评价制药废水对小鼠精子毒性。本发明可以简便、准确的检测生殖毒性进而评价其生物毒性。可以准确的检测与评估合成制药废水中POPs和EH对小鼠精子的毒性，研究合成制药废水安全浓度与剂量，为制定相应的废水排放标准提供可靠的基础数据。本发明不仅适用于合成制药废水的生物分子毒性检测，也适用于其它有毒有机废水毒性的检测与评估。
权利要求书
1、一种制药废水的生殖毒性检测与评价方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)以制药厂生产废水为测试废水，以小鼠为受试生物，通过经口灌胃对小 鼠进行染毒;
(2)测试期满后观察小鼠精子形态、计算精子畸形率;
(3)测定各类生精细胞百分率，将染毒组数据与对照组进行差异显著性检验;
(4)用检验结果来评价制药废水对小鼠精子毒性。
2、根据权利要求1所述的一种制药废水的生殖毒性检测与评价方法，其特征在 于步骤(1)中所述的制药厂废水中含有持久性有机污染物POPs和环境激素 EH类污染物。
3、根据权利要求2中所述的一种制药废水的生殖毒性检测与评价方法，其特征 在于步骤(3)中的各类生精细胞百分率是指单倍体、二倍体和四倍体细胞分 别占总生精细胞的百分率。
4、根据权利要求3中所述的一种制药废水的生殖毒性检测与评价方法，其特征 在于步骤(2)中按照小鼠精子畸变形图计数各组小鼠畸形精子数和精子总数， 计算精子畸形率。
5、根据权利要求1～4中所述的一种制药废水的生殖毒性检测与评价方法，其特 征在于步骤(2)中采用流式细胞仪进行检测。
说明书
一种制药废水的生殖毒性检测与评价方法
一、技术领域
本发明涉及一种制药废水的毒性检测与评价方法，更具体的说是一种制药废 水的生殖毒性检测与评价方法。
二、背景技术
评价毒物毒性的方法有很多，国内、国际上都已经有通过检测受试动物精子 形态的方法来评价毒物毒性的方法，北京医科大学用氯乙烯对小鼠进行吸入染 毒，观察精子形态，计算畸形率，评价其毒性。Quinto I等用美福铁和亚胺硫磷 等毒物对小鼠通过腹腔注射的方法染毒，然后观察精子形态、计算畸形率。没有 通过测试小鼠精子形态以及生精细胞百分率检测合成制药废水毒性的相关文献， 对于应用小鼠精子形态以及生精细胞百分率来评价合成制药废水毒性的方法目 前仍是空白。一些制药厂的生产废水，含有众多的有机物，尤其是合成生产神经 调节类药物的制药厂，废水中含有机氯及其它苯环与杂环化等有机污染物，其中 持久性有机污染物POPs(persistent organic pollutants)及环境激素EH (environmental hormone)类污染物多达十几种以上，而目前对于这种废水的 生物毒性及其对人类健康和生态安全所产生的危害还不清楚。由于常规的检测方 法与排放标准不足以准确检测与评估POPs和EH的生物分子毒性，所以评估 POPs和EH的环境健康危险性与生态安全风险性，至今还是一项国际性的重大 难题。
三、发明内容
1、要解决的技术问题
本发明的目的是提供一种制药废水的生殖毒性检测与评价方法，特别是对 其中含有持久性有机污染物POPs和环境激素EH类污染物制药厂废水，可以简便、 准确的检测生殖毒性进而评价其生物毒性。
2、技术方案
采用的技术方案如下：
一种制药废水的生殖毒性检测与评价方法，包括以下步骤：
(1)以制药厂生产废水为测试废水，以小鼠为受试生物，通过经口灌胃对小 鼠进行染毒;
(2)测试期(1～3个月)满后观察小鼠精子形态、计算精子畸形率;
(3)测定各类生精细胞百分率，将染毒组数据与对照组进行差异显著性检验;
(4)用检验结果来评价制药废水对小鼠精子毒性。
步骤(1)中所述的制药厂废水中含有持久性有机污染物POPs和环境激素 EH类污染物。步骤(3)中的各类生精细胞百分率是指单倍体、二倍体和四倍体 细胞分别占总生精细胞的百分率。步骤(2)中按照小鼠精子畸变形图计数各组 小鼠畸形精子数和精子总数，计算精子畸形率。
流式细胞仪DNA定量分析具体方法：流式细胞仪检测后，用配套软件分析后 可以得到单倍体、二倍体和四倍体细胞分别占总生精细胞的百分率，以 x±s表示， 应用excel统计软件进行t检验。判断样品组和对照组小鼠各种生精细胞所占 比例的差异显著性。单倍体细胞由精子细胞和精子组成，二倍体细胞由精原细胞、 次级精母细胞组成，四倍体细胞由初级精母细胞和处于G2M期精原细胞组成。单 倍体细胞百分数可以用于评估睾丸生精功能，因次级精母细胞存在的时间短，二 倍体细胞百分数可以指示精原细胞的数量。若染毒组小鼠的单倍体或二倍体生精 细胞百分率与对照组存在显著性差异，则说明该制药废水对小鼠的生精功能产生 损伤，具有一定的生殖毒性。
精子畸形率检测具体方法：在显微镜下观察染毒组与对照组小鼠精子形态， 按照小鼠精子畸变形图(来自：张希桥、杨志华.关于精子畸变分型的参考意见. 卫生毒理学杂志，1995，9(1)：46)计数各组小鼠畸形精子数和精子总数，计 算精子畸形率。用excel软件进行差异显著性的x2检验。判断染毒组和对照组小 鼠精子畸形率的差异显著性。若具有差异显著性，则说明该制药废水可对小鼠精 子产生损伤，使其精子畸形率上升，具有一定的生殖毒性。
3、有益效果
本发明提供了一种制药废水的生殖毒性检测与评价方法，可以简便、准确的 检测生殖毒性进而评价其生殖毒性。本发明可以准确的检测与评估合成制药废水 中POPs和EH对小鼠精子的毒性，研究合成制药废水安全浓度与剂量，为制定 相应的废水排放标准提供可靠的基础数据。本发明不仅适用于合成制药废水的生 物分子毒性检测，也适用于其它有毒有机废水毒性的检测与评估。